Image-iT™ LIVE Red and Green Caspase Apoptosis Detection Kits for microscopy

Nachweis und Bewerten von Caspase-Aktivierung, Membranpermeabilität und Zellzyklus mithilfe von Image-iT LIVE roten und grünen Poly- und Caspase-3- und -7-Apoptose-Detektionskits für die Mikroskopie, einschließlich Fluoreszenzmikroskopie und High-Content-Screening (HCS). Die Image-iT LIVE-Kits zum Nachweis roter und grüner Caspase utzen fluoreszierende Inhibitoren der Caspasen (FLICA)-Methodik zum Nachweisen und Melden der Caspase-Aktivität, ein Maß für die Zellapoptose. Insbesondere enthalten die Image-iT LIVE-Nachweiskits für rote und grüne Caspase die Substrate SR-VAD-FMK und SR-DEVD-FMK (für rote Fluoreszenz) bzw. FAM-VAD-FMK und FAM-DEVD-FMK (grüne Fluoreszenz) für Polycaspasen bzw. Caspase-3/7 Nachweis. Sie umfassen auch Hoechst 33342 und Propidiumiodid-Färbemittel, wodurch eine gleichzeitige Bewertung der Membranpermeabilität und des Zellzyklus durch Mikroskopie und HCS ermöglicht wird.

Die Image-iT LIVE-Kits zum Nachweis roter und grüner Caspase für die Mikroskopie verwenden einen neuartigen Ansatz zum Nachweis aktiver Caspasen: Beide Assay-Kits nutzen einen fluoreszierenden Inhibitor der Caspasen (FLICA)-Methode, eine Affinitätsmarkierung. Das Reagenz verbindet einen Fluoromethylketon (FMK)-Anteil, der kovalent mit einem Cystein reagieren kann, mit einer caspasespezifischen Aminosäuresequenz. Verschiedene Aminosäure-Erkennungssequenzen werden zum Nachweis verschiedener Caspasen verwendet: Valin-Alanin-Asparaginsäure (VAD) für Polycaspasen (einschließlich Caspase-1, -3, -4, -5, -6, -7, -8 und -9) und Asparaginsäure-Glutaminsäure-Valin-Asparaginsäure (DEVD) für Caspase -3/7. Eine Sulforhodamin (SR)-Gruppe oder Carboxyfluorescein-Gruppe (FAM) wird als Reporter angefügt.

Das FLICA-Reagenz soll über die Erkennungssequenz mit dem enzymatischen reaktiven Zentrum einer aktivierten Caspase interagieren und dann kovalent durch den FMK-Anteil anbinden. Der FLICA-Hemmer ist membrangängig und nicht-zytotoxisch. Ungebundene FLICA-Moleküle diffundieren aus der Zelle und werden weggespült; das verbleibende rot- oder grün-fluoreszierende Signal ist ein direktes Maß für die Menge an aktiver Caspase, die zum Zeitpunkt der Zugabe des Inhibitors vorhanden war. Die ungefähren Anregungs- und Emissionsspitzen der Reagenzien FLICA, Propidiumiodid und Hoechst 33342 betragen 488 nm⁄530 nm, 535 nm⁄617 nm bzw. 350 nm⁄461 nm. Die in den Image-iT LIVE Rot Polycaspasen, Rot Caspase-3/7, Grün Polycaspasen und Grün Caspase-3/7 Nachweiskits enthaltenen Nachweisreagenzien sind SR-VAD-FMK, SR-DEVD-FMK, FAM-VAD-FMK bzw. FAM-DEVD-FMK.