Custom TaqMan™ SNP Genotyping Assays

context sequenceはprobeがデザインされている領域を含んだターゲットSNP周辺部の配列です。 角カッコ [ ]に囲まれた塩基がSNPを示しており、[allele 1_VIC標識 /allele 2_FAM標識]となるようにアッセイがデザインされています。 具体的に例を挙げて説明しますと、以下のような配列がcontext sequenceとして表示されている場合： CTCCTCTGACACTGTCGCTTCTCCA[T/C]GGCATTAGATTTTCAGTCCTGCTCA 角カッコ [ ]に囲まれたSNPポジションに対して、上流および下流の25塩基の配列が表記されています。さらにSNPポジションの [T/C] については、T = allele 1でVIC標識、C = allele 2でFAM標識されていることを示しています。なおalleleの順番はランダムになっており、塩基の順番でmajor、minorのalleleを意味しているものではありません。

no template control とアサインされたサンプルについてですが、反応wellにDNAまたはアッセイを添加し忘れた可能性が考えられます。この場合は再度やり直して確認してください。 ただし、どちらのalleleも有していないサンプルについても、no templete controlにアサインされる場合がありますので注意してください。 再度繰り返しても同様に同じサンプルがno templete controlにアサインされた場合、gene dosage assayで確認することができます。このときSNP assayでまったく増幅が認められないサンプルについては、ターゲット領域を欠失している（コピー数が0)である可能性があります。

クラスターが3つ以上形成された場合、TaqMan probe上に別のSNPが存在しているか、もしくはターゲット配列のコピー数に多様性がある可能性があります。 確認のために再度アッセイを行ってください。このとき、以前と同じサンプルが外れ値にプロットされ、余分なクラスターを形成した場合、外れ値を示したサンプルのシーケンス解析を行い、ターゲットSNPに隣接する領域に別のSNPが存在しないかを確認することも可能です。 この予期しない余分なクラスターの形成は、コピー数の多様性によって生じる場合もあります。 ホモ接合型のサンプルの場合、コピー数多様性が存在しても、ホモ接合型のクラスターにプロットされます。問題はヘテロ接合型のサンプルで生じます。ヘテロ接合型でコピー数多様性が存在する場合、ヘテロクラスターと片方側のホモクラスターの間に4種類のクラスターを形成する可能性があります。当然、ホモ接合型のサンプルにも、気がつかないだけでコピー数多様性をもつサンプルが存在する可能性があります。このような場合、gene dosage assayを行い、各サンプルで、ターゲットとする遺伝子にコピー数の多様性があるか否かを確認することをお薦めします。

マイナーアレル頻度（minor allele frequency)が非常に低い場合（例：5％以下のrare allele）、単一のクラスターしか確認できないケースがあるかもしれません。 マイナーアレル頻度をwebsiteのリストから確認してください。 もし、解析に関連したAllele Nomenclatureが存在する場合、マイナーアレルを検出のために必要な個体群の数を決定するための参考論文を確認できると思います。

no template control の他に, SNP genotype が既知のpositive controlを設定してください。 positive controlを設定することで、assayのパフォーマンスを評価することができます。ただ残念ながら弊社ではpositive controlの販売を行っておりません。