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Outils de validation TALEN et CRISPR |
Méthodes de validation CRISPR pour optimiser et vérifier les expériences de modification génétique
La promesse de puissants systèmes de modification génétique pour créer des mutations génétiques spécifiques dans les cellules, les tissus ou in vivo pour des applications thérapeutiques demeure un moteur de l’industrie de la recherche sur la modification génétique.
Que vous réalisiez des expériences TALEN ou CRISPR, toutes les stratégies de modification génomique nécessitent un plan de validation pour évaluer la précision et la fiabilité des résultats attendus de modification génétique et réduire le risque de modification d’ADN non spécifique. La validation TALEN et CRISPR doit être effectuée à différentes étapes du flux de travaux de la modification génétique, de l’évaluation de la santé cellulaire à l’expression ciblée.
Techniques de validation CRISPR pour chaque étape du flux de travaux
Sélectionnez l’étape de votre flux de travaux pour afficher les techniques de validation recommandées.
Les études de culture cellulaire avec résistance aux antibiotiques et contrôle de validation à l’aide de l’expression fluorophore offrent des moyens simples de vérifier que les réactifs CRISPR ont été transférés par transfection.
- Études de culture cellulaire
- Contrôles de validation
- TEG-seq pour les effets hors cible
La détection des clivages, le séquençage, le transfert Western et la PCR sont des techniques efficaces pour confirmer une modification CRISPR.
L’analyse à haute densité et les études de culture cellulaire peuvent être utilisées pour valider les phénotypes. TEG-seq est une méthode intra-cellulaire développée pour mesurer les événements de clivage hors cible qui peuvent avoir été générés après la modification génétique.
Les études de culture cellulaire avec résistance aux antibiotiques et contrôle de validation à l’aide de l’expression fluorophore offrent des moyens simples de vérifier que les réactifs CRISPR ont été transférés par transfection.
- Études de culture cellulaire
- Contrôles de validation
- TEG-seq pour les effets hors cible
La détection des clivages, le séquençage, le transfert Western et la PCR sont des techniques efficaces pour confirmer une modification CRISPR.
L’analyse à haute densité et les études de culture cellulaire peuvent être utilisées pour valider les phénotypes. TEG-seq est une méthode intra-cellulaire développée pour mesurer les événements de clivage hors cible qui peuvent avoir été générés après la modification génétique.
Validez votre modification TALEN ou CRISPR avec un dosage T7 basé sur l’endonucléase
Le kit de détection du clivage génomique (GCD) GeneArt Invitrogen est un dosage d’endonucléase T7 conçu pour confirmer rapidement et en toute confiance les insertions, les délétions ou les modulations génétiques CRISPR ou TALEN. Avec un temps de manipulation minimal, de la récolte cellulaire aux résultats quantifiés, l’analyse de vos événements de modification génomique peut être réalisée en seulement quatre heures.
Données : Analyse sur gel des lysats cellulaires pour déterminer l’efficacité du clivage CRISPR à l’aide du kit de détection de clivage génomique Invitrogen GeneArt
Figure 1. Efficacité du clivage selon la méthode CRISPR-Cas9. Image de gel du dosage d’un clivage à l’aide du kit de détection du clivage génomique Invitrogen GeneArt pour le locus HPRT. (A) Résultats obtenus à l’aide du vecteur OFP de nucléase GeneArt CRISPR exprimant l’ARN CRISPR propre au HPRT. (B) Résultats obtenus à l’aide du vecteur CD4 de nucléase GeneArt CRISPR exprimant l’ARN CRISPR propre au HPRT. Après la transfection des cellules HeLa, des dosages de clivage ont été réalisés en triple et le pourcentage des indels a été calculé.
Contrôles positifs, négatifs et de délivrance pour la validation CRISPR
Le fait d’avoir les contrôles positifs, négatifs et de délivrance appropriés est pertinent pour le succès de toute stratégie de validation de modification génétique. Veuillez vous reporter à la gamme complète de contrôles CRISPR proposés par Thermo Fisher Scientific lors de la conception d’expériences de modification génétique, de la conception initiale à la validation de tous les travaux de modification génétique.
Validez l’efficacité de la modification TALEN et CRISPR-Cas9 avec le séquençage TALEN et CRISPR
Bien que les dosages de détection de clivage génomique (GCD) GeneArt soient rapides et peu coûteux, les résultats doivent être analysés plus en profondeur pour s’assurer que seule la mutation souhaitée a été introduite. Ceci peut être fait avec le séquençage de l’ADN.
Analyse des séquences TALEN et CRISPR avec séquençage de Sanger
Le séquençage de Sanger est un outil de validation essentiel pour les expériences TALEN et CRISPR en raison de son coût réduit pour le séquençage ciblé, le flux de travaux simple et l’analyse de données simples.
Données : Évaluation de l’efficacité de la modification CRISPR-Cas9 à l’aide du séquençage de Sanger
Le séquençage de Sanger peut être utilisé pour déterminer l’efficacité du clivage des nucléases. Dans l’expérience suivante, le lysat des cellules traitées a été séquencé à l’aide du logiciel SeqScanner 2. Les résultats ont montré une séquence mixte où la modification s’est produite (Figure 2A). Les résultats ont ensuite été analysés à l’aide du logiciel de suivi des indels par décomposition (TIDE, Brinkman, EK et al. (2014)). L’application de confirmation de modification génétique SeqScreener Gene Edit Confirmation sur Thermo Fisher Connect peut être utilisée pour déterminer le spectre et la fréquence des mutations ciblées.
Figure 2. Utilisation du séquençage de Sanger pour déterminer l’efficacité de la modification. (A) Une population mixte de cellules HEK293 présentant une modification du génome au niveau du locus HPRT humain a été analysée à l’aide du logiciel SeqScanner 2. Notez la position de la modification, indiquée par la flèche rouge. (B) Analyse de la trace de séquence à l’aide du logiciel TIDE. La fraction de la cellule pour laquelle on prévoit -1, -2, -3, etc. suppressions, ainsi que l’efficacité de la modification globale prévue, sont indiquées.
Conseil : une autre méthode pour déterminer l’efficacité du clivage de la nucléase consiste à sous-cloner l’amplicon des cellules traitées vers des plasmides et séquencer avec la méthode de Sanger l’insert dans des sous-clones bactériens individuels. Le comptage du nombre de sous-clones avec une modification réussie donne une mesure de l’efficacité de la réaction de modification et permet de visualiser le type de séquences résultant de la modification.
Téléchargez la note d’application : utilisation du séquençage de Sanger pour faciliter les flux de travaux de modification du génome avec CRISPR et TALENÉtudes de séquençage de TALEN et CRISPR avec séquençage de nouvelle génération (NGS)
NGS offre un outil puissant, avec des capacités à haut débit, pour l’analyse TALEN et CRISPR. Cette méthode offre une analyse qualitative et quantitative de toutes les mutations ciblées par TALEN et CRISPR. NGS peut analyser plusieurs échantillons à la fois pour déterminer avec précision quelles cellules ont la mutation ciblée TALEN ou CRISPR souhaitée. En outre, les effets hors cible peuvent être évalués à l’aide de l’analyse NGS TALEN et CRISPR pour plusieurs échantillons.
En savoir plus sur le NGS pour la validation TALEN et CRISPR
Visionnez la vidéo pour déterminer la méthode de séquençage la mieux adaptée à vos expériences CRISPR
Évaluez la santé cellulaire et le phénotype grâce aux études de culture cellulaire TALEN et CRISPR
Chaque étape du flux de travaux de modification génétique doit maintenir des cellules viables et saines. Les tests de viabilité, d’apoptose ou de réponse au stress doivent être un processus de routine et constituent une étape pertinente non seulement pour valider la modification efficace des gènes, mais aussi pour déterminer les conditions expérimentales optimales.
L’expression de fluorophore et la résistance aux antibiotiques sont deux techniques largement utilisées pour mesurer l’efficacité de la transfection ainsi que l’expression ciblée.
Données : Validez la délivrance de Cas9 à l’aide de l’immunocytochimie
L’immunocytochimie est une technique standard qui permet d’identifier certaines protéines dans la cellule. Avec un anticorps primaire anti-Cas9 et un anticorps secondaire marqué, il est possible de détecter l’expression de la protéine Cas9, cellule par cellule, par imagerie par fluorescence.
Figure 3. Surveillance de la délivrance de Cas9. (A) Les cellules U2OS et (B) U2OS-Cas 9 ont été traitées avec un anticorps monoclonal CRISPR-Cas9, puis colorées avec un conjugué de chèvre anti-souris Alexa Fluor 594 et Hoechst 33342. La coloration d’aspect ponctué rouge dans le cytoplasme montre la présence de Cas9. Les cellules ont été observées sur un système automatisé d’imagerie cellulaire EVOS FL.
Données : Validez la délivrance de Cas9 par lentivirus CRISPR à l’aide du comptage automatisé des cellules, de l’imagerie de lumière transmise et de la cytométrie en flux
Le choix d’un antibiotique, l’expression génique et les dosages d’immunocytochimie sont fréquemment utilisés pour surveiller l’assemblage de composants CRISPR en vue de la modification génétique de la cellule. Ces méthodes permettent de mesurer l’expression protéique fluorescente directement. Lorsqu’un antibiotique est sélectionné pour identifier les cellules transfectées, les dosages de viabilité servent à contrôler le processus de sélection.
Figure 4. Expression de la GFP mesurée à l’aide du compteur automatisé de cellules Countess II FL. Les cellules U2OS exprimant la protéine Cas9 ont été transduites avec l’ARNg de contrôle positif Invitrogen LentiArray (HPRT-GFP) et l’ARNg de contrôle négatif Invitrogen LentiArray (GFP brouillée), à une multiplicité d’infection de 1 et 2. Deux jours plus tard, les cellules ont été comptées et la GFP, mesurée, sur le compteur automatisé de cellules Countess II FL. Les mesures ont montré le pourcentage de cellules positives à la GFP et indiqué le pourcentage de cellules transduites exprimant la GFP et le gène résistant à la puromycine (2A et 2B).
Figure 5. Choix d’un antibiotique à l’aide du système d’imagerie EVOS XL Core pour l’imagerie de lumière transmise. Les cellules transduites à l’aide de particules de contrôle positif Invitrogen GeneArt Lentiviral CRISPR (HPRT-GFP) montrent une viabilité normale (A) avant le traitement. Au bout de quatre jours sous puromycine (B), les cellules sont agglomérées et stressées en réponse à l’antibiotique.
Figure 6. Mesure de l’efficacité de la transfection des cellules 293T par cytométrie en flux. Le vecteur de nucléase Invitrogen GeneArt CRISPR avec kit de rapporteurs OFP utilise l’expression d’une protéine fluorescente orange (OFP) pour marquer les cellules transfectées. L’efficacité de la transfection a été mesurée dans les cellules 293T à l’aide du cytomètre en flux Attune NxT et les données montrent un taux >90 % de cellules positifs à l’OFP dans les échantillons transfectés.
Transfert Western pour l’analyse CRISPR
Le transfert Western est une technique largement utilisée pour détecter et déterminer si des protéines spécifiques sont présentes dans l’échantillon analysé. Dans les expériences CRISPR, le transfert Western est utilisé pour déterminer l’efficacité de la transfection, ainsi que l’expression de mesure.
Données : Validez l’efficacité de la transfection CRISPR et l’expression des protéines avec le transfert Western
Dans la Figure 7, le transfert Western a été utilisé pour comparer l’expression de Cas9 dans les cellules transfectées avec différents formats CRISPR. Les changements phénotypiques peuvent également être quantifiés dans une population de cellules à l’aide du transfert Western, comme illustré dans la Figure 8.
Figure 7. Détection par transfert Western d’accumulation de Cas9 dans le temps, dans l’ADN plasmide, l’ARNm et les cellules transfectées par la protéine. Les cellules HEK293FT ont été transfectées avec l’ADN plasmidique Cas9, l’ARNm ou la protéine. Les cellules ont été prélevées aux moments indiqués en vue d’une analyse par transfert Western. Les protéines présentes dans le lysat cellulaire ont été séparées sur un gel NuPAGE Bis-Tris 4–12 %, transférées sur une membrane en PVDF à l’aide du dispositif de transfert de gel iBlot 2, incubées avec un anticorps monoclonal de souris Cas9 dilué à 1:3 000 et un anticorps secondaire de lapin conjugué à une HRP anti-souris à 1:2 000. La membrane a été développée à l’aide du substrat Pierce ECL. (Liang et. al., Journal of Biotechnology, 208, 44-53.)
Figure 8. Les cellules Hap1 modifiées par CRISPR accumulent la protéine LC3B après le traitement à la chloroquine. La LC3B peut être mesurée à l’aide de la microscopie quantitative ou du transfert Western.
Utilisation de la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) dans la validation TALEN et CRISPR
L’amplification par PCR des régions cibles peut être utilisée en association avec l’électrophorèse sur gel, la digestion par des enzymes de restriction, le séquençage de Sanger ou le NGS pour la validation TALEN et CRISPR. En outre, la PCR en temps réel peut être utilisée pour valider les niveaux d’expression génétique dans les cellules.
Analyse à haute densité (HCS) dans la validation CRISPR
Les plateformes d’imagerie à haute densité offrent une analyse à contenu élevé (HCS) exceptionnelle avec des capacités d’analyse des cellules simples et un temps de traitement des données ultra-rapide. Ces plateformes automatisées d’imagerie et d’analyse par fluorescence microscopique détectent les changements dans l’expression des protéines, la compartimentalisation et la morphologie des cellules ; toutes avec une rigueur quantitative. La HCS fournit à des sphéroïdes un phénotypage spontané non biaisé avec des cellules intactes, fixées ou vivantes dans des monocouches.
Données : Analyse de l’autophagie dans les cellules CRISPR modifiées à l’aide de l’HCS
Figure 9. Quantification automatique de l’autophagie par HCS. Une plateforme CellInsight CX7 Thermo Scientific a permis d’identifier et de compter les granulés LC3B dans les cellules HAP1 CRISPR modifiées. Les cellules ont été marquées au bleu HCS NuclearMask, au rouge profond HCS CellMask et avec un anticorps anti-LC3B suivi d’un anticorps de chèvre anti-lapin Alexa Fluor 647. Une analyse automatisée via Thermo Scientific HCS Studio 3.0 a permis d’identifier les noyaux (superposition bleue), le périmètre des cellules (contour vert) et les granulés LC3B quantifiés (superposition rouge sur l’image de fluorescence et le diagramme à barres).
La modulation des voies de signalisation cellulaire s’accompagne d’un risque de conséquences proximales et distales. Il est important de suivre les protéines ciblées et de surveiller l’impact sur les autres aspects de la santé et du comportement cellulaires. L’analyse à haute densité (HCS) convient tout particulièrement à ce type d’investigation à plusieurs paramètres et les réactifs Invitrogen offrent l’éventail d’outils destinés à l’examen de la santé et du comportement cellulaires.
Données : Analyse HCS de l’apoptose, du stress oxydatif, de la dégradation des protéines et de la synthèse des protéines dans les cellules modifiées par CRISPR
Figure 10. Analyse rapide de différents paramètres relatifs à l’état de santé des cellules à l’aide de la plateforme Thermo Scientific CellInsight CX5. Des cellules de type sauvage et des cellules Hap-1 modifiées par CRISPR ont été analysées via la plateforme à haute densité (HCS) CellInsight CX5, à la recherche (A) de signes d’apoptose avec un réactif de détection vert CellEvent Caspase-3/7, (B) de stress oxydatif avec les réactifs Invitrogen CellROX, (C) de dégradation des protéines avec les réactifs Invitrogen LysoTracker et (D) de synthèse des protéines avec un kit de dosage Invitrogen Click-iT OPP.
Pour plus d’informations sur la conception et la validation de TALEN sur mesure, visitez Services de conception et de validation TALEN.
Ressources et assistance pour la validation CRISPR
Applications associées
Notes d’application
Publication(s)
Gene editing resources and support
Resources
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For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.