Pierce™ Crosslink Magnetic IP/Co-IP Kit

Thermo Scientific Pierce架橋磁気IP/Co-IPキットは、架橋化学を使用して、IP抗体を高品質のタンパク質A/G磁気ビーズに共有結合的に固定し、効果的な免疫沈降および共免疫沈降を実現します。

この磁気IP手順では、免疫沈降に使用される特異的抗体の共有結合が必要なため、抗体がビーズに接着されたままであるため、抗体フラグメントなしで標的タンパク質またはco-IPタンパク質複合体を溶出し、分析できます。このキットには、タンパク質A/Gに結合し、高収量のIPまたはco-IPを達成するために必要な、最適化されたプロトコルとすべてのバッファーおよび試薬が含まれています。手動または自動の磁気分離ツールを使用します。

架橋磁気IP/Co-IPキットの特長：

•抗体フリーのIP—抗体は、磁気ビーズに不可逆的に結合されます。その結果、無傷の抗体または精製された抗原との重鎖および軽鎖の共溶出は無視できる程度になります。
• 便利—IP/co-IPキットには磁気ビーズと最適な免疫沈降のために必要なすべてのバッファーが含まれています
• 高速—3時間未満で架橋と免疫沈降が完了します
• 効率—他の磁気ビーズと比較すると、推奨される磁気粒子の半分の容量で免疫沈降できます
• 適合性—タンパク質A/G組換えタンパク質と結合した磁気ビーズは、マウスまたはウサギのいずれからでも、ほとんどの一次抗体との適合性を確保します
• 拡張可能—1回のIP実験に必要な量の抗体のみを使用、または複数回実験するために多量の抗体架橋された磁気ビーズを調整します。

Pierce架橋磁気IP/Co-IPキットのプロトコルは、IP抗体をタンパク質A/G磁気ビーズに結合し、スベリン酸ジサクシンイミジル（DSS）を使用して、抗体をビーズに共有結合的に架橋します。抗体を架橋したビーズは、目的のタンパク質抗原を含む細胞ライセートまたは組織抽出物とインキュベーションして、抗原：抗体複合体を形成します。ビーズは洗浄されて非結合物質が除去され、低pH溶出バッファーを使用して、結合した抗原を抗体架橋されたビーズから分離します中和バッファーが含まれているため、分離された抗原の沈殿を防ぎ、下流アプリケーションでのタンパク質活性を確保できます。レーンマーカーサンプルバッファーは、SDS-PAGE分析用のサンプルを調製するために含まれています。このプロトコルは、2～10 µgのIP抗体用に最適化されています。最適なco-IP収量を得るには、5～10 µgの抗体を使用してください。ビーズは、磁気スタンドを使用して溶液から手動で、またはThermo Scientific KingFisher Flexなどの装置を使用して自動で除去します。

従来のIP（共有結合抗体なし）は通常、架橋を使用するIPプロトコルより抗原収量が多くなります。これは、架橋プロセスにより、一部の機能的な抗体結合部位が失われることが不可避であるためです。架橋法によるこの制約を克服するには、架橋IP法では、同等の従来のIP手順よりもある程度多くのIP抗体を使用する必要がある場合があります。もちろん、架橋免疫沈降法の利点は、干渉する抗体バンドが存在しないウェスタンブロットです。

プロトコルの概要
1：1Xカップリングバッファーでビーズを事前洗浄します。
2：抗体をタンパク質A/G磁気ビーズに室温で15分間結合します。
3：1Xカップリングバッファーでビーズを3回洗浄します。
4：DSSを使用して抗体をビーズに30分間架橋します。
5：溶出バッファーでビーズを3回洗浄し、IP溶解／洗浄バッファーで2回洗浄します。
6：調整したビーズで細胞ライセートを室温で1～2時間または4℃で一晩インキュベートします
7：IP溶解／洗浄バッファーでビーズを2回洗浄し、精製水で1回洗浄します。
8：溶出結合抗原。

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