CRISPR-Validierungsmethoden zur Optimierung und Verifizierung von Geneditierungsexperimenten

Das Versprechen leistungsfähiger Geneditierungssysteme zur Erzeugung spezifischer genetischer Mutationen in Zellen, Geweben oder in vivo für therapeutische Anwendungen ist nach wie vor eine treibende Kraft für die Industrie der Geneditierungsforschung.

Unabhängig davon, ob Sie TALEN- oder CRISPR-Experimente durchführen, erfordern alle Genomeditierungsstrategien einen Validierungsplan, um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der erwarteten Ergebnisse der Geneditierung zu bewerten und das Risiko einer unspezifischen DNA-Editierung zu verringern. Die TALEN- und CRISPR-Validierung sollte bei verschiedenen Schritten des Geneditierungsablaufs durchgeführt werden, von der Bewertung der Zellgesundheit bis zur angestrebten Expression.


CRISPR-Validierungsverfahren für jeden Schritt des Arbeitsablaufs

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Zellkulturstudien mit Antibiotika-Resistenz und Validierungskontrolle mit Fluorophor-Expression bieten einfache Möglichkeiten, um zu überprüfen, ob CRISPR-Reagenzien via Transfektion eingebracht wurden. 

Spaltungsnachweis, Sequenzierung, Western Blotting und PCR sind effektive Verfahren zur Bestätigung eines CRISPR-Edits.

Mit High-Content-Screening und Zellkulturstudien können Phänotypen validiert werden. TEG-Seq ist eine intrazelluläre Methode, die zur Messung von Off-Target-Spaltungsereignissen entwickelt wurde, die möglicherweise nach der Geneditierung erzeugt wurden.

Step 1 : Übertragung bestätigen

Zellkulturstudien mit Antibiotika-Resistenz und Validierungskontrolle mit Fluorophor-Expression bieten einfache Möglichkeiten, um zu überprüfen, ob CRISPR-Reagenzien via Transfektion eingebracht wurden. 

Step 2 : Editiereffizienz messen

Spaltungsnachweis, Sequenzierung, Western Blotting und PCR sind effektive Verfahren zur Bestätigung eines CRISPR-Edits.

Step 3 : Phänotypen mithilfe funktioneller Analyse bestätigen

Mit High-Content-Screening und Zellkulturstudien können Phänotypen validiert werden. TEG-Seq ist eine intrazelluläre Methode, die zur Messung von Off-Target-Spaltungsereignissen entwickelt wurde, die möglicherweise nach der Geneditierung erzeugt wurden.


Validieren Sie Ihre TALEN- oder CRISPR-Edits mit einem T7-Endonuklease-basierten Assay

Das Invitrogen GeneArt Genomic Cleavage Detection (GCD) Kit ist ein T7-Endonuklease-Assay, der zur schnellen und sicheren Bestätigung von CRISPR- oder TALEN-Insertionen, Deletionen oder Genmodulationen entwickelt wurde. Mit minimalem Zeitaufwand – von der Zellgewinnung bis zur Quantifizierung der Ergebnisse – kann die Analyse Ihrer Genomeditierungsereignisse in nur vier Stunden durchgeführt werden.

Daten: Gelanalyse von Zelllysaten zur Bestimmung der CRISPR-Spaltungseffizienz mit dem Invitrogen GeneArt Genomic Cleavage Detection Kit

Gele, die die bestätigte Spaltung zeigen

Abbildung 1. CRISPR-Cas9-vermittelte Spaltungseffizienz Gelbild eines Spaltungsassays unter Verwendung des Invitrogen GeneArt Genomic Cleavage Detection Kits für den HPRT-Lokus. (A) Ergebnisse unter Verwendung des GeneArt CRISPR Nuklease-OFP-Vektors, der HPRT-spezifische CRISPR RNA exprimiert. (B) Ergebnisse, die unter Verwendung des GeneArt CRISPR Nuklease-CD4-Vektors, der HPRT-spezifische CRISPR RNA exprimiert, erzielt wurden. Nach der Transfektion in HeLa-Zellen wurden dreifache Spaltungsassays durchgeführt und der Prozentsatz der Indels wurde berechnet.


Positivkontrollen, Negativkontrollen und Transfektionskontrollen für die CRISPR-Validierung

Für den Erfolg jeder Validierungsstrategie in der Geneditierung ist es wichtig, die richtigen Positiv-, Negativ- und Transfektionskontrollen zu haben. Bitte beachten Sie das vollständige Sortiment an CRISPR-Kontrollen von Thermo Fisher Scientific bei der Planung von Geneditierungsexperimenten, vom ersten Entwurf bis zur Validierung aller Genedits.

Erfahren Sie mehr über die Kontrollen für die TALEN- und CRISPR-Validierung


Validieren Sie die TALEN- und CRISPR-Cas9-Editiereffizienz mit TALEN- und CRISPR-Sequenzierung.

Obwohl GeneArt Genomic Cleavage Detection (GCD) Assays schnell und kostengünstig sind, müssen die Ergebnisse genauer analysiert werden, um sicherzustellen, dass nur die gewünschte Mutation eingebracht wurde. Dies kann mit Hilfe der DNA-Sequenzierung geschehen.

TALEN-und CRISPR-Sequenzanalyse mit Sanger-Sequenzierung

Die Sanger-Sequenzierung ist ein wesentliches Validierungsinstrument für TALEN- und CRISPR-Experimente, da die Kosten für die gezielte Sequenzierung geringer sind, der Arbeitsablauf einfach und die Datenanalyse unkompliziert ist. 

Erfahren Sie mehr über Sanger-Sequenzierung für die TALEN- und CRISPR-Validierung

Daten: Eine Bewertung der CRISPR-Cas9-Editiereffizienz mittels Sanger-Sequenzierung

Mithilfe der Sanger-Sequenzierung kann die Effizienz der Nuklease-Spaltung bestimmt werden. Im folgenden Experiment wurde Lysat aus behandelten Zellen mit der SeqScanner 2-Software sequenziert. Die Ergebnisse zeigten eine gemischte Sequenz, in der die Editierung stattfand (Abbildung 2A). Die Ergebnisse wurden dann mit der TIDE-Software (Tracking of Indels by Decomposition ) analysiert (TIDE, Brinkman, EK et al (2014)). Die SeqScreener Gene Edit Confirmation App auf Thermo Fisher Connect kann zur Bestimmung des Spektrums und der Häufigkeit der gezielten Mutationen verwendet werden.

: Sanger-Sequenzierungsdaten in Verbindung mit einem Balkendiagramm des Indel-Spektrums, das zur Bestimmung der CRISPR-Editiereffizienz verwendet wird

Abbildung 2. Bestimmung der Editiereffizienz mittels Sanger-Sequenzierung. (A) Eine gemischte Population von HEK293-Zellen mit einer Genomeditierung im menschlichen HPRT-Locus wurde mit Hilfe der SeqScanner 2 Software analysiert. Beachten Sie die Position der Editierung (roter Pfeil). (B) Analyse des Sequenz-Trace mittels TIDE-Software. Abgebildet ist der Anteil an Zellen, von denen Deletionen der Typen -1, -2 bzw. -3 usw. erwartet wurden, sowie die Gesamteffizienz der Editierung.

TIPP: Eine andere Methode zur Bestimmung der Effizienz der Nuklease-Spaltung ist die Subklonierung des Amplikons von behandelten Zellen in Plasmide und die anschließende Sanger-Sequenzierung der Insertion in einzelnen bakteriellen Subklonen. Die Anzahl der Subklone mit einer erfolgreichen Editierung entspricht der Effizienz der Editierungsreaktion und bietet eine Visualisierung der Sequenztypen, die aus der Editierung resultieren.

Anwendungshinweis herunterladen: Verwendung der Sanger-Sequenzierung zur Vereinfachung von CRISPR- und TALEN-vermittelten Arbeitsabläufen bei der Genomeditierung

TALEN- und CRISPR-Sequenzierungsstudien mithilfe von Next-Generation-Sequenzierung (NGS)

NGS ist ein leistungsstarkes und durchsatzstarkes Werkzeug für die TALEN- und CRISPR-Analyse. Diese Methode bietet sowohl ein qualitatives als auch ein quantitatives Screening aller TALEN- und CRISPR-gerichteten Mutationen. NGS ermöglicht es, viele Proben auf einmal zu analysieren, um exakt zu bestimmen, welche Zellen die gewünschte TALEN- oder CRISPR-gerichtete Mutation aufweisen. Außerdem können mit TALEN- und CRISPR-NGS-Analysen Off-Target-Effekte für mehrere Proben bewertet werden.

Erfahren Sie mehr über NGS für die TALEN- und CRISPR-Validierung
Sehen Sie sich das Video an, um festzustellen, welche Sequenzierungsmethode für Ihre CRISPR-Experimente am besten geeignet ist.


Ermitteln Sie die Zellgesundheit und den Phänotyp mit TALEN- und CRISPR-Zellkulturstudien.

Jeder Schritt des Arbeitsablaufs der Geneditierung muss lebensfähige und gesunde Zellen erhalten. Das Testen auf Viabilität, Apoptose oder Stressreaktionen sollte ein Routineverfahren sein und ist ein wichtiger Schritt nicht nur zur Validierung der effektiven Genmodifikation, sondern auch zur Ermittlung optimaler Versuchsbedingungen.

Fluorophorexpression und Antibiotikaresistenz sind zwei weit verbreitete Techniken zur Messung der Transfektionseffizienz sowie der zielgerichteten Expression.

Daten: Validierung der Cas9-Transfektion mithilfe von Immunzytochemie

Immunzytochemie ist ein allgemein gültiges Verfahren für die Erkennung bestimmter Proteine innerhalb der Zelle. Unter Verwendung eines anti-Cas9 primären Antikörpers und eines markierten sekundären Antikörpers kann die Cas9-Exprimierung durch Fluoreszenzbildgebung Zelle für Zelle erkannt werden.

Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von Kontroll- und Cas9-exprimierenden U2OS-Zellen
Abbildung 3. Kontrolle der Cas9-Transfektion (A) U2OS-Zellen und (B) U2OS-Cas 9-Zellen wurden mit monoklonalem CRISPR-Cas9-Antikörperbehandelt und anschließend mit einem Ziege-anti-Maus Alexa Fluor 594-Konjugat und Hoechst 33342gefärbt. Eine rote punktuelle Färbung im Zytoplasma zeigt das Vorhandensein von Cas9. Die Zellen wurden unter Verwendung eines EVOS FL Automatischen Zellbildgebungssystems visualisiert.

Daten: Validieren Sie die CRISPR-Cas9-Lentivirus-Transfektion mithilfe von automatisierter Zellzählung, Durchlicht-Bildgebung und Durchflusszytometrie

Antibiotika-Selektion, Genexpression und Immunzytochemie-Assays werden weithin verwendet, um die Assemblierung von CRISPR-Komponenten für die Geneditierung in der Zelle zu überwachen. Die Expression fluoreszierender Proteine kann direkt gemessen werden und bei Erkennung transfizierter Zellen mit Hilfe von Antibiotika-Selektion können Viabilitätsassays verwendet werden, um den Selektionsprozess zu überwachen.

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Abbildung 4. Mithilfe des Countess II FL automatischen Zellzählers gemessene GFP-Expression. U2OS-Zellen, die das Cas9-Protein exprimieren, wurden mit Invitrogen LentiArray Positive Ctrl gRNA (HPRT-GFP) und Invitrogen LentiArray Negative Ctrl gRNA (Scrambled-GFP) mit MOIs von 1 und 2 umgewandelt. Zwei Tage später wurden die Zellen auf dem Countess II FL Automatischen Zellzähler gezählt und hinsichtlich GFP bestimmt. Aus den Messungen ging der Prozentsatz von GFP-positiven Zellen hervor, welche Angaben zum Prozentsatz transduzierter Zellen, die das GFP- und Puromycin-Resistenzgen (2A und 2B) exprimieren, liefern.

Mikroskopische Durchlichtaufnahmen von transduzierten Zellen, die mit oder ohne Puromycin kultiviert wurden
Abbildung 5. Antibiotika-Auswahl mit dem EVOS XL Core Imaging System für die Durchlicht-Bildgebung Zellen, die mit Invitrogen GeneArt Lentiviral CRISPR Positive Ctrl-Partikeln (HPRT-GFP) transduziert wurden, zeigen vor der Behandlung eine normale Viabilität (A) . Nach vier Tagen unter der Puromycin-Selektion (B) sind die Zellen als Reaktion auf das Antibiotikum zusammengeklumpt und gestresst.
Zwei durchflusszytometrische Streudiagramme, die die OFP-Intensität und die Seitenstreuung zur Bewertung der Transfektionseffizienz zeigen

Abbildung 6. Bestimmung der Transfektionseffizienz in 293T-Zellen unter Verwendung von Durchflusszytometrie. Der Invitrogen GeneArt CRISPR Nuklease-Vektor mit OFP Reporter Kit nutzt die Exprimierung eines orangefarbenen fluoreszierenden Proteins (OFP), um transfizierte Zellen zu markieren. Die Transfektionseffizienz wurde in 293T-Zellen unter Verwendung des Attune NxT Durchflusszytometers bestimmt und die Daten zeigen >90 % OFP-positive Zellen in transfizierten Proben.


Western Blot für CRISPR-Analysen

Western Blotting ist eine Technik, die weithin verwendet wird, um zu erkennen und zu bestimmen, ob bestimmte Proteine in der untersuchten Probe vorhanden sind. In CRISPR-Experimenten wird Western Blotting zur Bestimmung der Transfektionseffizienz sowie zur Messung der Expression verwendet.

Daten: Validieren der CRISPR-Transfektionseffizienz und Proteinexpression mithilfe von Western Blot

In Abbildung 7wurde das Western Blotting verwendet, um die Expression von Cas9 in Zellen zu vergleichen, die mit verschiedenen CRISPR-Formaten transfiziert wurden. Zudem können mit Western Blotting phänotypische Veränderungen in einer Zellpopulation quantifiziert werden, wie in Abbildung 8dargestellt.

Ein Western Blot, der die Cas9-Akkumulation über 0 bis 72 Stunden in mit Plasmid-DNA, mRNA und Protein transfizierten Zellen zeigt. Die Transfektion von Proteinen konnte bereits nach 4 Stunden nachgewiesen werden, mRNA ist nach 4 bis 48 Stunden nachweisbar, und Plasmid-DNA ist nach 24 bis 72 Stunden reichlich vorhanden.

Abbildung 7. Western-Blot-Nachweis der Cas9-Akkumulation im Laufe der Zeit in mit Plasmid-DNA, mRNA und Protein transfizierten Zellen. HEK293FT-Zellen wurden mit Cas9 Plasmid-DNA, mRNA oder Protein transfiziert. Die Zellen wurden zu den angegebenen Zeiten geerntet, um die Western-Blot-Analyse durchzuführen. Proteine im Zelllysat wurden auf einem Invitrogen NuPAGE 4 bis 12 % Bis-Tris-Gel getrennt, mithilfe des iBlot 2 Gel Transfer Geräts an eine PVDF-Membran übertragen, mit einem monoklonalen Cas9 Maus-Antikörper mit einer Verdünnung von 1:3.000 und einem Kaninchen-anti-Maus HRP-konjugierten sekundären Antikörper mit einer Verdünnung von 1:2.000 inkubiert. Die Membran wurde mit Pierce ECL Substrat entwickelt. (Liang et. al., Journal of Biotechnology, 208, 44–53.)

Zellen, die blaue und grüne Fluoreszenzen abgeben, um die Akkumulation von LC3B nach der Chloroquin-Behandlung zu zeigen. Ebenfalls gezeigt wird ein Western Blot, der eine Bande bei 17 kDa zeigt, die LC3B entspricht.

Abbildung 8. CRISPR-editierte Hap1-Zellen akkumulieren nach der Chloroquin-Behandlung LC3B. LC3B kann durch quantitative Mikroskopie oder Western Blotting gemessen werden.


Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bei der TALEN- und CRISPR-Validierung

Die PCR-Amplifikation von Zielregionen kann in Kombination mit Gelelektrophorese, Restriktionsdigest, Sanger-Sequenzierung oder NGS zur TALEN- und CRISPR-Validierung eingesetzt werden. Darüber hinaus kann die Echtzeit-PCR eingesetzt werden, um das Niveau der Genexpression in Zellen zu überprüfen.

Erfahren Sie mehr über PCR für die TALEN- und CRISPR-Validierung


High-Content-Screening (HCS) bei der CRISPR-Validierung

High-Content-Bildgebungsplattformen bieten ein außergewöhnliches High-Content-Screening (HCS) mit Einzelzell-Analysefunktionen und äußert schnellem Zugriff auf Daten. Diese automatisierten mikroskopischen Fluoreszenzbildgebungs- und Analyseplattformen erkennen Veränderungen in der Proteinexpression, der Kompartimentierung und der Zellmorphologie – und das alles mit quantitativer Präzision. HCS bietet unverzerrte spontane Phänotypisierung mit intakten, festen oder lebenden Zellen in Monoschichten oder Sphäroiden. 

Daten: Autophagie-Analyse in CRISPR-editierten Zellen unter Verwendung von HCS

Drei Mikroskopaufnahmen von Zellen, die verschiedene Fluoreszenzfarben exprimieren, und ein Balkendiagramm mit den quantifizierten Messwerten

Abbildung 9. Automatische Quantifizierung der Autophagie unter Verwendung von HCS. Eine Thermo Scientific CellInsight CX7 Plattform wurde verwendet, um LC3B Granulate in CRISPR-editierten HAP1-Zellen zur ermitteln und zu zählen. Zellen wurden mit HCS NuclearMask Blau, HCS CellMask Dunkelrot und einem Anti-LC3B-Antikörper gefolgt vom Alexa Fluor 647 Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper markiert. Automatische Analyse unter Verwendung der Thermo Scientific HCS Studio 3.0 identifizierten Zellkerne (blauer Overlay), des Zellumfangs (grüner Umriss) und der quantifizierten LC3B Granulate (roter Overlay im Fluoreszenzbild und im Balkendiagramm).

Mit der Modulation eines Zellsignalwegs geht das Risiko von proximalen und distalen Konsequenzen einher. Es ist wichtig, dass Sie die Zielproteine nachverfolgen und außerdem die Auswirkungen auf andere Aspekte der Zellgesundheit und des Zellverhaltens überwachen. High-Content-Screening (HCS) eignet sich besonders gut für diese Art der Multiparameter-Untersuchung und Invitrogen Reagenzien bieten die gesamte Bandbreite an Hilfsmitteln für die Untersuchung der Zellgesundheit und des Zellverhaltens.

Daten: HCS-Analyse von Apoptose, oxidativem Stress, Proteinabbau und Proteinsynthese in CRISPR-editierten Zellen

Vier Dosis-Wirkungs-Diagramme der Zellfluoreszenzintensität gegenüber der Medikamentenkonzentration zur Messung von Zellapoptose, oxidativem Stress, Proteinabbau und Proteinsynthese.

Abbildung 10. Schnelle Analyse unterschiedlicher Parameter der Zellgesundheit unter Verwendung der Thermo Scientific CellInsight CX5 Plattform. Wildtyp- und CRISPR-editierte Hap-1-Zellen wurden unter Verwendung der CellInsight CX5 HCS Plattform (A) unter Verwendung der CellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagenz auf Apoptose, (B) unter Verwendung von Invitrogen CellROX Reagenzien auf oxidativen Stress, (C) unter Verwendung von Invitrogen LysoTracker Reagenzien auf Proteinabbau und (D) unter Verwendung eines Invitrogen Click-iT OPP Assay-Kits auf Proteinsynthese analysiert.

Weitere Informationen zum individuellen Design und zur Validierung von TALEN finden Sie unter TALEN-Leistungen – Vom Design bis zur Validierung.

Ressourcen und Support für die CRISPR-Validierung
Zugehörige Anwendungen
Anwendungshinweise
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For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.