mMESSAGE mMACHINE™ SP6 Transkriptionskit

mMESSAGE mMACHINE™ Kits wurden speziell für die In-vitro-Synthese großer Mengen von gecappter RNA entwickelt. Gecappte RNA imitiert die meisten eukaryotischen mRNAs in In-vivo-Verfahren durch ein 7-Methylguanosin-Cap am 5'-Ende. mMESSAGE mMACHINE™ Kit-Reaktionen enthalten das Cap-Analogon [m⁷G(5')ppp(5')G] in einer Transkriptionsreaktion mit überaus hoher Ausbeute. Das Cap-Analogon wird nur als erstes oder 5'-terminales G der Transkription eingefügt, da seine Struktur die Ingration an jeder anderen Stelle im RNA-Molekül verhindert.

Funktionsweise der mMESSAGE mMACHINE™ Kits
mMESSAGE mMACHINE™ Kits haben ein vereinfachtes Reaktionsformat, in dem alle vier Ribonukleotide und das Cap-Analogon in einer einzigen Lösung gemischt werden. Das Verhältnis Cap-Analogon/GTP beträgt in dieser Lösung 4:1, optimal für eine Maximierung der RNA-Ausbeute und des Anteils von Transkripten mit Cap. mMESSAGE mMACHINE™ Kits sind ideal für die routinemäßige Synthese von gecappten RNA für die Mikroinjektion von Oozyten, die In-vitro-Translation, die Transfektion und für andere Anwendungen. Die hohe Ausbeute wird durch die Optimierung der Reaktionsbedingungen für die RNA-Synthese bei hohen Nukleotidkonzentrationen erreicht. Darüber hinaus ist die synthetisierte RNA vor Zersetzung durch kontaminierende Ribonukleasen geschützt, die mit dem RNase-Hemmer — einer Komponente des Enzym-Mix – vorhanden sein können.

Verwendung von mMESSAGE mMACHINE™-Kits
Bei einer 20 µl-Reaktion während einer 2-stündigen Inkubation ergibt die mMESSAGE mMACHINE™ Transkription gecappter RNA mit hoher Ausbeute große Mengen gecappter RNA. Bis zum 10–50-fachen der Ausbeute, die durch konventionelle In-vitro-Transkriptionsreaktionen erzielt werden kann. Das Verhältnis von Cap-Analogon zu GTP wurde optimiert, um den besten Kompromiss zwischen Ertrag (15–35 µg) und Anteil der Transkripte mit Cap-Struktur (80 %) zu ermöglichen. mMESSAGE mMACHINE™ Kits enthalten auch eine LiCl-Fällungslösung zur effizienten Trennung der Proteine und ungebundenen Nukleotide (einschließlich freier Cap-Analoga) von der gecappten RNA, was die Translation noch effizienter gestaltet. mMESSAGE mMACHINE™ Kits sind nur für die Verwendung mit den im Kit enthaltenen Polymerasen optimiert. Die Verwendung einer anderen Polymerase kann zu einer niedrigen Ausbeute führen. mMESSAGE mMACHINE™ Kits enthalten alle notwendigen Reagenzien und Puffer für 25 Transkriptionsreaktionen. Mit dem im Lieferumfang der Kits enthaltenen Kontroll-Template (Xenopus-Elongationsfaktor 1α, pTRI Xef) entsteht bei jeder mMESSAGE mMACHINE™ Reaktion rund 20–30 µg RNA bei Verwendung von T3- oder T7-RNA-Polymerase oder etwa 15–25 µg RNA bei Verwendung von SP6-RNA-Polymerase.