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载体特性

ori是复制起点,即复制起始处的序列。它决定了载体拷贝数。例如,pUCori可产生高拷贝数,而pBR322 ori则可产生低拷贝数。ori是质粒在细菌中复制所必需的。

pCR™II载体是一种双启动子载体,它在多克隆位点的5’端和3’端分别具有一个T7启动子和Sp6启动子。pCR™2.1载体只含有T7启动子(去除了Sp6启动子)。如果想使用插入片段做体外转录研究,使用双启动子载体更有优势。从克隆效率来看,pCR™2.1和pCR™II载体没有区别。pCR™2.1和pCR™II载体均含有测序引物位点(M13引物位点),从而可以沿两个方向对插入片段进行测序。

TA克隆

这种克隆方法最初是为配合纯Taq聚合酶(天然的、重组的、热启动)使用而设计的;然而,某些高保真Taq酶和Taq酶混合物通常也适合TA克隆。即使Taq与具有校正能力的聚合酶以10:1或15:1的比例,仍可以产生足够的3’ A突出端去做TA克隆。

推荐使用的我公司的聚合酶包括Platinum Taq、Accuprime™ Taq、Platinum或Accuprime™ Taq High Fidelity、AmpliTaq、AmpliTaq Gold或AmpliTaq Gold 360等。

平末端克隆

使用Pfx50、Platinum或Accuprime Pfx等具有校对能力的酶。

定向TOPO克隆

Pfx50或AccuPrime™ Pfx效果良好。

T4 DNA聚合酶和大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段,均可将突出端分子转变成平末端分子。但T4 DNA聚合酶的3’—5’核酸外切酶活性比Klenow更强。

CIP/CIAP 或BAP可以对DNA/RNA的5’端去磷酸化;T4多核苷酸激酶可以添加磷酸基团。

原核生物mRNA含有Shine-Dalgarno序列,也称为核糖体结合位点(RBS),它是由AUG起始密码子5’端的多嘌呤序列AGGAGG组成。该序列与16S rRNA 3’端的互补,有助于mRNA有效结合到核糖体上。同理,真核生物(特别是哺乳动物)mRNA也含有完成有效翻译所需的重要序列信息。然而,Kozak序列不是真正的核糖体结合位点,而是一种翻译起始增强子。Kozak共有序列是ACCAUGG,其中AUG是起始密码子。-3位的嘌呤(A/G)具有重要作用;若-3位是一个嘧啶(C/T),翻译过程会对-1、-2和+4位的改变更敏感。当-3位从嘌呤变为嘧啶时,可使表达水平降低多达95%。+4位对表达水平的影响相对较小,可以使表达水平降低约50%。

注:果蝇的最佳Kozak序列稍有不同,酵母完全不遵循这些规则。见下列参考文献:

  • Foreign Gene Expression in Yeast: a Review. Yeast, vol. 8, p. 423-488 (1992).
  • Caveneer, Nucleic Acids Research, vol. 15, no. 4, p. 1353-1361 (1987).

ATG通常足够启动有效的翻译,尽管翻译也取决于目标基因。最好的建议是,沿用在cDNA中发现的天然起始位点,除非确定该位点在功能上不理想。如果担心表达的不好,建议测试两种设计,一种使用天然起始位点,另一种使用共有Kozak序列。一般来说,所有具有N端融合的表达载体,都会具有一个翻译的RBS或起始位点。

IRES是内部核糖体进入位点,可使翻译起始不依赖于末端。研究人员通常在克隆2个或更多基因时会使用IRES,以期这些基因能够在同一个启动子下表达。

目标基因末端的终止序列可以使转录终止。转录终止子的实例如下:

  • 大肠杆菌:T7终止子
  • 酵母:AOX和CYC1终止子
  • 昆虫:SV40终止子
  • 哺乳动物:SV40和BGH polyA
  • 病毒:3’ LTR

通过将标签与目标基因融合表达,可以利用标签对目标基因进行检测或快速纯化。标签可加在目标基因的N端或C端。以下是使用标签时的注意事项:

  1. N端标签可以含有蛋白酶切割位点。
  2. N端标签包含RBS/Kozak位点。
  3. 分泌信号通常是加在N端的,在高尔基体内加工过程中会被自动切割
  4. 替代GOI中存在的天然分泌信号。
  5. 当C端对蛋白质功能很重要时,应选择N端标签
  6. 使用N端标签时,应确保目标基因的末端具有一个终止密码子。
  7. 如果使用N端标签,应确保您的基因与标签基因在同一个读码框内。
  8. 如果N端对蛋白质功能很重要或蛋白是未鉴定过的,应选择C端标签。
  9. 如果要将您的目的基因和C末端标签基因进行融合表达,确保删除您的目标基因中的终止密码子;终止密码子应该存在于标签基因的C端。
  10. 使用C端标签时,应确保目标基因含有起始密码子(ATG),如果需要的话还要加上RBS/Kozak位点。
  11. 如果使用C端标签,应确保标签与您的基因在同一个读码框内。

以下是帮助您选择标签的一些基本原则:

目的 描述 标签实例
检测 该标签的抗体性能明确,方便可视化 V5, Xpress, myc, 6XHis, GST, BioEase, capTEV GFP, Lumio
纯化 有可用的树脂方便后续蛋白纯化 6XHis, GST, BioEase, capTEV
可切割性 具有蛋白酶识别位点(TEV、EK),在表达后可以切除标签,获得天然蛋白 任何后面(仅限N端标签)带有蛋白酶识别位点的标签

一个表达载体通常包含以下要素:

  • 目的基因表达框(包括启动子-基因-终止信号或poly A信号)
  • 针对特定宿主的筛选用的抗生素元件
  • 针对大肠杆菌的筛选用的抗生素元件
  • 细菌复制起点

其他要素包括:

  • 克隆位点
  • 标签
  • 分泌信号(N端)

不可以,这些载体不包含功能性启动子以表达您的目的基因。这些载体通常用于亚克隆或测序。

ExpressLink™ T4 DNA连接酶可以缩短连接时间,并实现室温下连接。对于TA克隆,该酶的连接时间为15分钟,而原始T4 DNA连接酶需要孵育至少4小时至过夜。对于平末端克隆,使用ExpressLink™ T4 DNA连接酶的连接时间为5分钟,而使用T4 DNA连接酶需要1小时。当使用我们的对照PCR插入片段和上述最低连接孵育时间/温度时,这两种酶的性能相似,克隆效率为80%。

连接

这取决于您的应用。对于含有黏性末端的双链DNA片段之间的连接,两种酶都能使用。大肠杆菌DNA连接酶需要β-NAD存在,而T4 DNA连接酶需要ATP。然而,只有T4 DNA连接酶可以连接平末端DNA片段;大肠杆菌连接酶不可用于这类片段的连接。

大肠杆菌DNA连接酶通常用于第二链cDNA合成中修复缺口。在第二链cDNA合成中,T4 DNA连接酶不可代替大肠杆菌DNA连接酶,因为T4 DNA连接酶对平末端ds cDNA片段连接的功能,可能导致形成嵌合插入。

您可能需要尝试不同的插入片段:载体比例,范围从1:1至15:1。

公式:

Formula

(插入片段长度 (bp) X 载体重量(ng) ) / 载体长度 (bp) = 插入片段:载体比例为1:1时所需的插入片段重量(ng)

在一个连接反应中,至少有一个分子(例如插入片段或载体)必须是磷酸化的。连接反应取决于DNA分子上5’磷酸的存在。去磷酸化载体与限制性内切酶消化生成的插入片段(磷酸化的)结合,是最常见的方式。尽管DNA只有一条链可连接在接合点,但是也可形成稳定环状结构的分子,前提条件是插入片段足够长,双链杂交产生的力量能够维持分子的环状结构。

推荐浓度取决于载体和插入片段的大小或插入片段的性质,但对于大多数质粒克隆或亚克隆反应来说,推荐的载体浓度为1-10 ng/µl。插入片段的摩尔浓度通常超过载体的2倍或3倍。

筛选

如果使用包含lac启动子和LacZ α片段(用于α互补)的载体,蓝/白筛选可作为筛选插入片段是否存在的工具。X-gal作为LacZ酶的底物需要加到反应板中,是蓝/白斑筛选必需的。完全破坏LacZ基因表达所需的最小插入片段大小为400 bp。如果存在Laclq抑制子(来自宿主细胞,如TOP10F',或由质粒表达),它将抑制lac启动子介导的表达,从而阻碍蓝/白筛选。因此,当存在Laclq抑制子时,必须使用IPTG抑制Laclq。只有抑制了Laclq,才能实现蓝/白筛选中的lac启动子介导的表达。X-gal(也称为5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)可溶于DMSO或DMF,其溶液形式可在冰箱中储存长达6个月。溶液需避光保存。X-gal和IPTG在琼脂板中的终浓度:倾注平板前,在培养基中加入X-gal至终浓度20 mg/mL,IPTG 加至终浓度0.1 mM。若直接涂在反应板表面,则加入40 µl X-gal (20 mg/mL储液)和4 µl IPTG (200 mg/mL储液)。

含有LacZ-ccdB表达框的TOPO载体,可通过破坏对大肠杆菌致死的基因ccdB的表达而直接筛选重组体。PCR产物的连接,可破坏LacZ-ccdB融合基因的表达,从而仅允许转化所得的阳性重组体生长,而含有非重组载体的细胞则将死亡。因此,无需蓝/白筛选。对含有LacZ-ccdB表达框的TOPO载体的克隆进行蓝/白筛选时,可看见菌落呈现不同的蓝色阴影。根据我们的经验,浅蓝色和白色的菌落通常含有插入片段。浅蓝色克隆的形成是由于在有插入片段的情况下发生了部分LacZ基因的转录但ccdB的表达没有达到杀死细胞的水平,这是和插入片段有关的。为了完全破坏lacZ基因的表达,插入片段必须>400 bp;因此,一个300 bp的插入片段可产生浅蓝色菌落。出现不含插入片段的白色菌落,通常是因为ccdB基因的自发性突变。

为了确保破坏ccdB基因表达,防止细胞死亡,需要的插入片段最小为150 bp。(参考文献:Bernard et al., 1994. Positive-selection vectors using the F plasmid ccdB killer gene. Gene 148: 71-74.)

含F质粒的菌株,如TOP10F’,不推荐用于转化和筛选任何含ccdB基因的TOPO载体的重组克隆。F质粒可编码ccdA蛋白,一种ccdB旋转酶-毒素蛋白的抑制剂。ccdB基因也存在于F质粒的ccd(细胞死亡控制)位点。该位点含2个基因,ccdA和ccdB,可分别编码含72和101个氨基酸的蛋白。ccd位点通过杀死分裂后不含F质粒的细胞而维持F质粒的稳定性的。当ccdA蛋白不发挥抑制作用时,ccdB蛋白是一种强力的可以杀死细胞的蛋白。

如果使用包含lac启动子和LacZ α片段(用于α互补)的载体,蓝/白筛选可作为筛选插入片段是否存在的工具。X-gal作为LacZ酶的底物需要加到反应板中,是蓝/白斑筛选必需的。完全破坏LacZ基因表达所需的最小插入片段大小为400 bp。如果存在Laclq抑制子(来自宿主细胞,如TOP10F',或由质粒表达),它将抑制lac启动子介导的表达,从而阻碍蓝/白筛选。因此,当存在Laclq抑制子时,必须使用IPTG抑制Laclq。只有抑制了Laclq,才能实现蓝/白筛选中的lac启动子介导的表达