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常规问题

将感受态细胞保存在高于-70摄氏度的地方,即使只是保存很短的时间,也会显著降低转化效率。细胞可能仍然是活的,但将不会很好的转化。可以使用一个对照质粒,如pUC19,进行一次测试反应,以确定细胞的转化效率。这可以帮助您确定这些细胞是否还适合用来进行您的实验。

我们不建议将感受态细胞保存在液氮中,因为这会损害细胞。另外,装感受态细胞的管子可能承受不了如此低的温度,从而发生破裂。

XbaI切割位点是一个Dam甲基化敏感限制性酶切位点。TOP10是一种dam(+)菌株,它表达甲基化酶Dam。您可以试试重新转化一种dam(–)菌株,例如INV110。其它dam(–) (以及dcm(–))敏感的限制性酶切位点包括:

  • Dam: Bcl I, Cla I, Hph I, Mbo I, Mbo II, Taq I, Xba I, BspH I, Nde II, Nru I
  • Dcm: Ava II, EcoO 109 I, EcoR II, Sau96 I, ScrF, Stu I, Aat I, Apa I, Bal I, Kpn I, ISfi I

如果您使用的是一种mcr/mrr(+)感受态细胞株,其细胞内的酶可能会识别酵母基因组DNA上的真核细胞甲基化序列并将其删除或重排。请尝试用一种mcr/mr(–)菌株例如Top10, DH10B™, 或OmniMAX™ 2进行转化。

以下这些因素会导致这一情况:涂板时所用的SOC培液或其它培液受到了污染,DNA被具有氨苄抗性的微生物所污染,平板时间过久氨苄降解失效,或者感受态细胞本身被污染了。
TOP10F’中的F’游离体带有一个lacIq标志物,它可以过表达lac抑制子。必须将IPTG和X-gal一起加入平板中才能在该菌株内看到β-半乳糖苷酶的表达和蓝色的出现。而TOP10则不需要IPTG就能进行蓝白斑筛选。

我们建议尝试以下措施:

  • 进行pUC19转化对照;这可以告诉您所用感受态细胞的转化能力信息。
  • 检查平板的过期时间以及是否使用了正确的培液(LB/琼脂)。
  • 确认使用了正确的抗生素并且浓度也是对的。

无论使用何种菌株,您所要做的第一件事都是降低生长温度至30摄氏度或更低(室温)。慢速生长通常可以让E. coli更加耐受复杂序列。如果降低生长温度没有帮助,则您可能需要考虑使用其它感受态细胞比如Stbl2™或Stbl4™细胞,这类细胞已被证明在同等条件下对于上述复杂序列的耐受程度比其它菌株高。

当使用高电压在导电缓冲液中进行电转时,可能会出现电火花。MgCl2和PO4的导电能力尤其强。

以下为一些建议:

  1. 将克隆反应的离子强度保持在最小。如果反应缓冲液含有高盐,在电转前请将DNA样本用水或TE缓冲液稀释。
  2. 尽量避免加入导电离子。DNA溶液的体积不应超过反应总体积的5%。例如:40 μl细胞中加入2 μl DNA。
  3. 确保没有气泡存在。
  4. 确保电极接触是干净紧密的。擦除电转杯外面的任何沉淀物。
  5. 要获得最佳结果,细胞应当被加入缝隙的最底部。轻弹电转杯使细胞沉降到底部。
虽然没有特定菌株更适合进行大质粒转化,但是关注转化效率是非常重要的。对于大质粒,推荐使用效率最高的化学感受态细胞,例如OmniMAX™ 2,TOP10,等等。对于超过20 kb的质粒,建议使用电转感受态细胞以获得最高的转化效率。
请检查您所用的菌株的基因型。我们的Gateway®目的载体通常含有一个ccdB基因元件,该元件如果不被破坏,则E. Coli生长将受到抑制。因此,未进行克隆的载体应该在ccdB survival菌株如我们的ccdB Survival™ 2 T1R感受态细胞中扩增。

以下是一些建议:

  • 小片段/接头而不是您的插入片段被克隆进了您的载体。要解决这一问题,请在连接前对插入片段进行凝胶纯化。
  • 确保使用了正确的X-gal和/或IPTG(当载体带有lacIq标志物时)浓度。
  • 在平板上涂布X-gal和/或IPTG时,留出足够的时间让试剂充分扩散进入平板。
  • 孵育平板足够长的时间以确保颜色完全显现。
确保您使用了正确的抗生素和合适的浓度。另外,确保抗生素没有过期。如果克隆的形态和预期不同,那么污染可能是一个原因。检测您的SOC培液和LB培液。
亚克隆级别的DH5α™可以使用,但是转化的效率会低一些(10e6 vs 10e9),因此得到的克隆数可能较少。 Top10F’细胞也可以使用,但是如果要进行蓝白斑筛选,需要同时加入IPTG和X-gal,因为带有F’游离体的细胞会表达lacIq抑制子。

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