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概述

有,下表对我们提供的两种藻类进行了对比:

  聚球藻属 衣藻属
有机体 细长聚球藻(Synechococcus elongatus)Pcc7942 莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)137c
细胞类型 原核——蓝藻(蓝绿藻) 真核——单细胞绿藻
基因组大小 2.7 Mb 121 Mb
培养基 BG11——蓝藻类通用 TAP——仅用于衣藻
整合 在中性位点1(Neutral Site 1) 随机
大肠杆菌(E. coli)质粒扩增的筛选 壮观霉素(100 μg/mL) 氨苄青霉素(100 μg/mL)
GOI的启动子 Psc = 弱组成型启动子*(pSyn_1 载体)或PpsbA = 强组成型启动子(pSyn_6载体) Hsp70A-RbcS2 =强组成型(Hsp 70和RbcS2杂合体)
整合筛选 壮观霉素(10 μg/mL) 潮霉素(10 μg/mL)
转化藻类使用的质粒类型 超螺旋质粒 线性化质粒(如xScaI)
TOPO载体中是否含RBS
限制性酶切载体中是否含RBS 否(pSyn_1载体)
是(pSyn_6载体)
沉默应用 尚无报道 可能有困难,取决于基因序列和蛋白毒性;pChlamy_4载体经过设计,可表达出带有sh-ble的转录融合蛋白,可带来更高的表达水平。Zeocin筛选有助于维持传代过程中的基因表达。
ATG序列 pSyn_1载体无起始密码子(来自内源基因或加到引物中);pSyn_6载体的ATG起始密码子位于NdeI克隆位点 载体已提供(Intro-1 Rbc S2)
转录终止 rrnB = 强
UTR   3’ UTR在MCS后(pChlamy_3和pChlamy_4)**

* 最初的pSyn_1载体含PNI启动子,是由镍诱导的;但是,若加入过多镍,则会对细胞产生毒性,所以将启动子变为Psc。因此,不再推荐使用镍诱导。
**最初的pChlamy_1载体不含3’ UTR,应在插入片段上紧随终止密码子后的位置加入一个3’ UTR,从而使其能够表达高水平的重组蛋白。

下图A描述了木聚糖酶克隆到pChlamy_4载体并转化到Chlamydomonas reinhardtii 137C中。利用EnzChek Ultra木聚糖酶检测试剂盒进行检测,发现酶活性比原来的系统高17.6倍。图B描述了B-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因克隆pSyn_6并转化到Synechococcus elongatus中。结果,GUS活性水平比我们原来的系统高100倍以上。

平均预期时间常数是15-20毫秒。我们的使用手册中有Neon电穿孔法实验方案。

是稳定转染。

可能存在。很遗憾,基因沉默是藻类表达中的一个大问题。沉默程度取决于基因序列和从该基因表达到细胞中的蛋白的毒性。

基因工程试剂盒专用于随机插入目的基因,这会导致目的基因快速丢失。该蛋白表达试剂盒含有pChlamy_4载体,经过设计可表达出带有博来霉素/Zeocin抗性基因sh-ble的转录融合蛋白(Rasala et al., 2012)。口蹄疫病毒(FMDV)2A肽段的自切割序列位于抗生素抗性基因和目的基因之间。该序列可编码一个约20个氨基酸的短序列,介导发生适当切割并产生2个独立蛋白。我们使用该系统得到的阳性转化株,即使在有或无筛选压力下传代多次之后,依然能够维持高表达水平,其持续时间远远长于其他系统。

很遗憾,我们尚未在其他类型的绿藻中对TAP培养基进行测试。有证据表明,Chlorella可在维生素增强型TAP培养基中生长,但我们没有详细信息。

我们的预制TAP生长培养基专为衣藻优化(货号A1379801)。请查看以下配方:
TAP培养基

项目 配方 (% w/v)
EDTA(二钠盐) EDTA 0.0005%
七水硫酸锌 ZnSO4·7H2O 0.002%
硼酸 H3BO3 0.001%
四水氯化锰 MnCl2·4H2O 0.005%
六水氯化钴 CoCl2·6H2O 0.002%

我们提供的专为蓝藻类优化的即用型培养基为BG-11(货号A1379901)。BG-11培养基有多种配方。请查看以下配方:
我们的BG-11培养基能够培养细长聚球藻(Synechococcus elongatus,PCC 7942株)。

项目 配方 (%w/v)
硼酸 H3BO3 0.00287%
四水氯化锰 MnCl2·4H2O 0.00181%
七水硫酸锌 ZnSO4·7H2O 0.00022%
二水钼酸钠 Na2MoO4 0.00039%
五水硫酸铜 CuSO4·5H2O 0.00008%
硝酸钠 NaNO3 0.15000%
二水氯化钙 CaCl2.·2H2O 0.00270%
枸橼酸铁铵(绿色) C6H5+4yFexNyO7 0.00120%
EDTA EDTA 0.00010%
磷酸氢二钾 K2HPO4 0.00390%
七水硫酸镁 MgSO4·7H2O 0.00750%
一水碳酸钠 Na2CO3·H2O 0.00200%

GeneArt基因合成被用于合成质粒骨架。同时,GeneArt是合成生物学的伞型品牌,产品覆盖面非常广,也包含了这些藻类试剂盒。

可通过OD750检测细胞生长,线性范围将在0.2-1.2(在1 cm光路中)之间。如果所得OD值过高,请稀释并再次检测。完全生长通常需要5-6天。可利用Life Technologies™的Countess细胞计数仪或Tali细胞计数仪进行精确检测。计算细胞数量的公式如下:

细胞浓度(细胞/mL)= (OD750 – 0.088)/9 × 108 = (OD750 – 0.088)/(9 × 10-8)

请注意,我们的COA指出,“将240 μl的冻存细胞复苏,并使用6 mL Gibco TAP培养基在28°C和50 μE下培养。生长6天后,在750 nm下检测光密度。光密度必须达到0.6。每批次至少取6管进行存活率测试”。

推荐使用我们的Synechococcus试剂盒,其整合是针对藻类基因组的中性位点1(Neutral Site 1)。

衣藻蛋白表达

衣藻细胞保存6个月后不会丧失活力。据估计,衣藻细胞的保存时间可能达到更久,但我们尚未数据证明保存一年后会丧失活力。

我们提供的是莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)137c株,它被认为是野生型实验室株,交配类型为“mt +”。

衣藻具有无细胞壁和有细胞壁两种类型;137c有细胞壁。

衣藻细胞应该是深绿色。浅绿色或无色(也可能是沿管侧面有一些液滴)细胞表示经过冻融或温度波动,而衣藻细胞对此极为敏感。

该试剂盒不是为长期保存阳性筛选克隆而设计的。大多数人在使用时将培养皿放在室温(不是4°C,因为它们需要光照)下的实验台上,根据需要反复划线。使用藻类的GeneArt低温保存试剂盒,可将藻株和克隆保存在–80°C数年。

很遗憾,我们尚未对其他藻类进行测试。

这类载体的转染是稳定转染。

整合是随机的。基因工程试剂盒是基于随机插入,这会导致目的基因快速丢失。蛋白表达试剂盒含有pChlamy_4载体,经过设计可表达出带有博来霉素/Zeocin抗性基因sh-ble的转录融合蛋白(Rasala et al., 2012)。口蹄疫病毒(FMDV)2A肽段的自切割序列位于抗生素抗性基因和目的基因之间。该序列可编码一个约20个氨基酸的短序列,介导发生适当切割并产生2个独立蛋白。我们使用该系统得到的阳性转化株,即使在有或无筛选压力下传代多次之后,依然能够维持高表达水平,其持续时间远远长于其他系统。

我们未报导衣藻细胞的转化效率,因为转化的最终结果是随机整合到基因组。电穿孔结果取决于目的基因。每个电穿孔反应中,对照载体应产生最少30个转录株。在每个挑选出的菌落中,目的基因阳性克隆数应不少于90%。

预期时间常数是15-20毫秒(平均为17毫秒)。

衣藻在保存6个月后不会丧失活力。我们目前尚未对超过6个月的保存时间进行测试。

建议,如果您想使用pChlamy_1载体表达高水平的重组蛋白,您的插入片段需要在紧随终止密码子后的位置含有一个3’ UTR(非翻译区域)。

是的,pChlamy_3载体在多克隆位点后含有一个3’ UTR。

需要。对于TOPO载体,您可通过设计引物,使编码序列与ATG一起位于载体的读码框内。

pChlamy_1载体无终止密码子和3' UTR。pChlamy_3载体含有3’UTR,已被证明可增强蛋白表达。

pChlamy_4载体专为避免发生常出现于C. reinhardtii的转基因沉默而设计。同时,该载体经过设计可表达出带有博来霉素/Zeocin抗性基因(sh-ble)的转录融合蛋白。口蹄疫病毒(FMDV)2A肽段的自切割序列位于抗生素抗性基因和目的基因之间。该序列可编码一个约20个氨基酸的短序列,介导发生适当切割并产生2个独立蛋白。我们使用该系统得到的阳性转化株,即使在有或无筛选压力下传代多次之后,依然能够维持高表达水平,其持续时间远远长于其他系统。

请查看以下载体:

It includes the pChlamy_4 vector. This vector has been tested for protein expression in Chlamydomonas reinhardtii 137c . You can get the Chlamydomonas reinhardtii 137c cells from the Chlamydomonas Resource Center (http://www.chlamycollection.org/).

聚球藻蛋白表达

使用的是Synechococcus elongatus PCC 7942,一种模型蓝藻。

在基因组中性位点1(Neutral Site 1)之间和质粒的NSa和NSb之间发生双重同源重组事件,从而将目的基因和壮观美素抗性整合到中性位点1内的基因组中。

聚球藻在保存6个月后不会丧失活力。我们尚未对超过6个月的保存时间进行测试。

pSyn_1的启动子是Psc。Psc是一种弱组成型启动子,可启动目的基因的本底表达。该启动子来自集胞藻PCC6803的茄呢酰二磷酸酯合酶基因。注意:该弱组成型启动子适用于受强表达阻碍的应用,如通路基因工程或低水平表达型突变基因的互补作用(Simkovsky et al., 2012)。

pSyn_6的启动子是psbA启动子(PpsbA)。PpsbA是细长聚球藻psbA基因(编码光合系统II蛋白D1)的一种强组成型启动子,可启动目的基因的高水平表达。pSyn-6载体还包括一个用于有效起始翻译的核糖体结合位点(GAAGGAG)和一个终止密码子。载体骨架还包含一个6xHis TEV和一个V5-His附加表位,用于检测/纯化目的基因。两种载体都含有NS1(中性位点1)同源重组位点,用于将载体整合到细长聚球藻基因组中。

It includes the pSyn_6 vector. This vector has been tested for protein expression in the Synechococcus elongatus PPC 7942. You can get the Synechococcus elongatus PPC 7942 from academic resources (http://genome.jgi.doe.gov/synel/synel.home.html) or from the ATCC Collection (https://www.atcc.org/products/all/33912.aspx).

低温保存

是的,我们提供藻类GeneArt低温保存试剂盒(货号A24228)。

只需将您的细胞在低温保存试剂A中培养2-5天,收集细胞,然后重悬于低温保存试剂B,随后冻存细胞即可。

我们通过检测发现,使用试剂盒保存衣藻(Chlamydomonas)株和小球藻(Chlorella)株时,细胞活力分别为5%和100%。

GeneArt低温保存试剂盒可用以下冻存盒:

  • Thermo Scientific™ Mr. Frosty冻存盒
  • Biocision™ CoolCell™ FTS30细胞冻存盒

The GeneArt Cryopreservation Kit for Algae was developed for preserving the Chlamydomonas reinhardtii 137c cells. We have reports from some customers who were successfully able to preserve other algae cells.

转化试剂

我们提供用于藻类的MAX Efficiency转化试剂(货号A24229)。8种不同的Chlamydomonas reinhardtii株——CC1690、CC2935、CC1009、CC4414、CC118、CC536、WT137c和CC3395 wall(-)——均使用藻类MAX Efficiency转化试剂及通过电穿孔用TAP/蔗糖试剂进行转化。以下数据显示,与使用TAP/蔗糖培养基相比,使用藻类MAX Efficiency转化试剂对C. reinhardtii WT137c进行培养可获得1000倍以上的克隆数(右)。

The MAX Efficiency Transformation Reagent for Algae was developed for transforming the pChlamy_4 vector into the Chlamydomonas reinhardtii 137c cells by electroporation.

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