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概述

下列文章对叶绿体转化与核转化的优势做了一些讨论,请查看:

  • Fischer et al.  (2004)  Plant-based production of biopharmaceuticals.  Curr Opin Plant Biol 7:152–158.
  • Kindle et al.  (1991_  Engineering the chloroplast genome: Techniques and capabilities for chloroplast transformation in Chlamydomonas reinhardtiiProc Natl Acad Sci U S A 88:1721–1725.

很遗憾,基因沉默是藻类表达中的一个大问题。沉默程度取决于基因序列和从该基因表达到细胞中的蛋白的毒性。pChlamy_4载体专为避免发生常出现于C. reinhardtii的转基因沉默而设计。同时,该载体经过设计,可表达出带有博来霉素/Zeocin抗性基因(sh-ble)的转录融合蛋白。口蹄疫病毒(FMDV)2A肽段的自切序列位于抗生素抗性基因和目的基因之间。该序列可编码一个约20个氨基酸的短序列,介导发生适当切割并产生2个独立蛋白。我们使用该系统得到的阳性转化株,即使在有或无筛选压力下传代多次之后,依然能够维持高表达水平,其持续时间远远长于其他系统。

pSyn_1的启动子是Psc。Psc是一种弱组成型启动子,可启动目的基因的基础表达。而pSyn_6的启动子是psbA启动子(PpsbA)。PpsbA是细长聚球藻psbA基因(编码光合系统II蛋白D1)的一种强组成型启动子,可启动目的基因的高水平表达。

 

请查看以下建议:

1.     为得到最佳结果,藻类细胞浓度应在1 x 106至2 x 106细胞/mL之间(OD范围为0.3-0.5)。细胞浓度不可超过3 x 106细胞/mL。可通过OD750检测细胞生长,线性范围将在0.2-1.2(在1 cm光路中)之间。如果OD值超出线性范围,请稀释并再次检测以获得准确读数。

公式为:细胞数= (OD750 – 0.088)/ 9 × 106 /mL

2.     线性DNA转化比环状DNA转化的效率高很多(有效率约高出70%)。

3.     DNA的质量和浓度对于转化效率至关重要。您将需要使用PureLink® HQ、PureLink® HiPure或相同质量的质粒纯化试剂盒进行DNA纯化。使用小体积的浓缩纯化DNA要比使用大体积的低浓度DNA更好。(如果您在转化线性质粒,则在线性化之后,您将需要在转化前使用凝胶提取或PCR净化试剂盒对质粒进行纯化处理。)我们建议每次电穿孔使用2 µg的线性质粒DNA。

4.     质粒DNA是随机插入到基因组的。通常,只有20%的转化株会明显表达目的基因。我们建议首先通过菌落PCR对菌落进行筛选,确保启动子和目的基因的完全整合,随后通过筛选多个阳性克隆,挑选出表达水平最高的克隆。

5.     由于C. reinhardtii基因组具有非常高的GC含量(约62% GC),如果目的基因适应了高表达C. reinhardtii基因的密码子使用偏好,则重组基因的表达水平会明显改善。

6.     由于转化效率取决于构建体向基因组的随机整合,电穿孔结果将取决于目的基因的性质。您可尝试转化试剂盒中的对照载体,从而确认试剂盒及其电穿孔方法是有效的。  

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