查找有价值的信息。

我们总结了一系列要点提示和技巧并建立了一个详细的知识库,以满足您的各类科研需求,助您优化试验,获得最理想的结果。

浏览下列相关问题答疑:

 

实验遇到问题了吗?请访问我们的

问题排查页面

 

更多信息请浏览我们常见问题解答数据库 ›

表达载体

表达载体通常包含以下元件:

  • 目的基因表达阅读框(包括启动子-基因-终止子或poly(A)信号)
  • 适用于特定宿主的抗生素筛选阅读框
  • 适用于大肠杆菌的抗生素筛选阅读框
  • 细菌复制起点

附加元件包括:

  • 克隆位点
  • 表位标签
  • 分泌信号(N端)

请浏览下表来了解常用的组成型和诱导型启动子。

宿主

组成型启动子

诱导型启动子

诱导剂

大肠杆菌

通常没有

Lac(乳糖操纵子);
araBAD(阿拉伯糖操纵子)

IPTG
阿拉伯糖

酵母

GAP(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)

AOX1(乙醇氧化酶);
GAL1(半乳糖生物合成)

甲醇
半乳糖

昆虫

Ac5(肌动蛋白);
OpIE1和2,PH(polyhedron,多角体)

MT(金属硫蛋白)

哺乳动物

CMV(巨细胞病毒),EF-1(人延伸因子-1),UbC(人泛素C),SV40(猿猴病毒40)

带有TetO2(四环素操纵子)的启动子;
带有GAL4 UAS(酵母GAL4上游激活序列)的启动子

四环素或强力霉素;
米非司酮

不能;尽管可生成转录本,但是没有翻译启始所需的核糖体结合位点(RBS)或Shine-Dalgarno序列。因此,大肠杆菌中将会转录mRNA,但不会翻译为蛋白。

核糖体结合位点(RBS)是mRNA分子5'(上游)的区段,能够结合核糖体正确定位至翻译启始位点。RBS能够控制mRNA翻译启始的准确度和效率。

在原核mRNA中,RBS位于起始密码子(即第一个AUG)上游7个核苷酸处。本序列也称为Shine-Dalgarno序列,是由位于AUG起始密码子5'端的多鸟苷酸序列AGGAGG所组成的。由于这一序列能够与30S核糖体亚基中16S rRNA的3'端实现互补,因此该信使RNA能够与核糖体高效结合。Shine-Dalgarno序列是必需的。

真核生物中的蛋白合成过程与这一模型不同。mRNA的5'端具有一个经修饰的化学结构(“帽”结构),能够被核糖体所识别,后者随之与mRNA相结合并沿着mRNA移动(“扫描”)直至找到第一个AUG密码子。碱基的特征模式(称为“Kozak序列”)有时在该密码子的周围被发现,以使人想起Shine-Dalgarno序列的方式帮助正确定位mRNA,但不与核糖体RNA形成碱基配对。因此,Kozak序列并非是核糖体结合位点,而是一个翻译启始增强子。保守的Kozak序列为G/ANNAUGG,其中的AUG表示起始密码子。-3位点的一个嘌呤(A/G)碱基具有显性效应;如果-3位点是一个嘧啶(C/T)碱基,则翻译进程会对-1,-2和+4位点的改变更为敏感。当-3位点从嘌呤变为嘧啶时,表达水平可能降低达95%以上。+4位点对于表达水平的影响较低,只发现有50%左右的降低影响。注意:酵母不遵循这一规则。果蝇中优化的Kozak序列会有些许的不同(C/AAAA/CAUG)。

ATG通常对于高效的翻译启始是足够的,尽管翻译效率要视目的基因而定。最佳的建议应是保持cDNA中天然起始位点,除非确定这一位点的功能性不理想。如果从表达的角度来考虑,推荐构建并测试两种载体,一个具有天然的起始位点,另一个具有保守的Kozak序列。通常情况下,所有N-端融合型表达载体都已包含了一个RBS或翻译起始位点。

IRES的全称为内部核糖体进入位点,能够介导不依赖末端的翻译启始过程。如果想在同一个启动子下,表达两个乃至更多基因,科研人员通常会在它们间加入IRES位点。

转录过程的终止是目的基因序列后的终止序列所介导的。以下列举了一些转录终止子的例子:

大肠杆菌:T7终止子

酵母:AOX与CYC1终止子

昆虫:SV40终止子

哺乳动物:SV40与BGH

病毒:3'LTR

通常情况下,引入表位标签是为了与您的目的基因进行融合,来使目的基因更易检测或快速纯化。表位标签可融合于目的基因的N-端或C-端。使用表位标签时有一些需要考虑的事项:

  1. N-端标签可能含有蛋白酶切割位点
  2. N-端标签中含有RBS/Kozak序列
  3. 分泌信号肽一般位于N-端,并能够在高尔基体加工过程中自动被切割
  4. 如果目的基因中含有天然分泌信号,则需将其替换
  5. 当蛋白的C-端对于其功能至关重要时,请选用N-端标签
  6. 当使用N-端标签时,请确保目的基因的末端含有终止密码子
  7. 如果使用N-端标签,请确保目的基因与标签处于同一阅读框中
  8. 当N-端对于蛋白功能至关重要时,或蛋白功能域未经鉴定时,请选择使用C-端标签
  9. 在与C-端标签融合时,请确保去除了目的蛋白的终止密码子;终止密码子应位于C-端标签末端
  10. 在使用C-端标签时,请确保在目的基因的起始部位包含起始密码子(ATG)和RBS/Kozak序列(如果需要的话)
  11. 如需引入一个C-端标签,请确保该标签与目的基因处于同一阅读框中

这里有一些用于帮助您选择表位标签的基础指南:

目的

描述

标签举例

检测

针对该标签有经良好验证的抗体
易于可视化的标签

V5, Xpress, myc, 6XHis, GST, BioEase™, capTEV™, GFP, Lumio™

纯化

有易于纯化的树脂

6XHis, GST, BioEase™, capTEV™

可切割

为了在表达后去除标签以获得天然蛋白,引入蛋白酶识别位点(TEV,EK)

任一标签(仅位于N-端)后面都附带了蛋白酶识别位点

我们所提供A、B和C型载体之间的差异在于载体多克隆位点(MCS)中增加或删除了单个碱基对。这些单个碱基的改变在每种类型的载体上形成了三种不同的阅读框。这些特性将帮助用户通过特定的限制性内切酶,插入目的基因使其与C-端标签在同一阅读框中。三种阅读框A、B和C的载体将以三个独立的试剂管形式提供。

表达系统

请参考下表,以了解每种系统的不同特性:

特性

大肠杆菌

酵母

昆虫

哺乳动物

细胞生长

迅速(30分钟)

快速(90分钟)

慢(18-24小时)

慢(24小时)

生长培养基的复杂性

复杂

复杂

生长培养基的成本

表达水平

低-高

低-高

低-中等

胞外表达

分泌至周质

分泌至培养基

分泌至培养基

分泌至培养基

翻译后修饰

中等

蛋白折叠

通常需要重新折叠

通常需要重新折叠

正确折叠

正确折叠

N型糖基化

高甘露糖

简单,无唾液酸

复杂

O型糖基化

磷酸化

乙酰化作用

酰化作用

Gamma-羧酸作用

宿主生物

最常见应用

优势

挑战

无细胞

  • 毒性蛋白
  • 整合非天然标签或氨基酸
  • 功能分析
  • 蛋白间相互作用
  • 快速表达筛选
  • 开放系统;能够加入非天然成份
  • 快速表达
  • 简单形式
  • 可扩展
  • 限于微克级
  • 扩大至毫克级可能性价比不高

原核生物

  • 结构分析
  • 抗体生成
  • 功能分析
  • 蛋白间相互作用
  • 可扩展
  • 低成本
  • 简单的培养条件
  • 蛋白溶解度
  • 可能需要蛋白特异性的优化
  • 可能难于表达某些哺乳动物蛋白

酵母

  • 结构分析
  • 抗体生成
  • 功能分析
  • 蛋白间相互作用
  • 真核蛋白加工
  • 扩大至发酵应用(每升克级)
  • 需简单培养基
  • 非常高的产量需要发酵
  • 可能需要优化生长条件

昆虫

  • 功能分析
  • 结构分析
  • 抗体生成
  • 与哺乳动物蛋白加工类似
  • 比哺乳动物系统更高的得率

更苛刻的培养条件

哺乳动物

  • 功能分析
  • 蛋白间相互作用
  • 抗体生成

最高水平的蛋白加工

  • 只有悬浮培养物能够达到每升几克的得率
  • 更苛刻的培养条件

藻类

  • 研究光合作用,植物生物学,脂类代谢
  • 遗传工程
  • 生物燃料生产
  • 光合微藻的遗传修饰与表达系统
  • 生物燃料,营养品和特种化学品生产的精湛实验控制
  • 强力筛选和表达的优化系统

 

 

需要了解更多信息?敬请联系我们 ›