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概述

这里列举了一些可能导致蛋白不表达的最常见原因/解决办法:

  • 低转染效率:开展稳转筛选或采用能够检测单个细胞的技术手段,优化您的转染操作。您也可尝试通过替换启动子来提高表达水平。
  • 所采用的检测手段可能无法有效检测细胞内的表达水平:优化检测方案或寻找更为灵敏的方法。
  • 蛋白可能被截短或降解:通过Northern杂交进行检查。
  • 可能存在时间-进程问题:蛋白表达水平可能基于蛋白天然属性而随时间变化而变化;因此推荐检测不同时间点的蛋白表达水平。
  • 可能存在溶解性问题:在大肠杆菌中过表达蛋白可能会形成包涵体,后者在标准的SDS-PAGE样品缓冲液和煮沸条件下不可溶;如需检查不可溶成份,可能需要使用6-8M的尿素和超声处理。
  • 可能存在克隆问题:通过限制性酶切和/或测序来验证克隆的准确性;确保其中存在正确的表达元件。

这里列举了一些具有抗生素抗性的克隆不表达目的基因最为常见的可能原因/解决方案:

  • 所用检测法可能不适当或不够灵敏。
  • 筛选到的克隆数不够。
  • 稳转筛选中所用的抗生素浓度不当(请确保获得了准确的致死曲线);对于稳转筛选的操作而言,您目的基因的整合位点十分重要,不同的整合位点会导致不同的表达水平。
  • 基因产物的表达(即使低水平)可能与该细胞系的生长不相容(即您的目的基因为毒性基因)。因此,请尝试使用诱导表达系统。
  • 如果您已经使用了诱导表达系统,请确保蛋白表达未发生泄漏情况。
  • 阴性克隆可能是由于目的基因表达的关键载体位点处优先发生了线性化。

同时检查细胞裂解产物和培养基中是否存在目的蛋白。尽管带有分泌信号序列的大多数蛋白会被分泌,但并非所有蛋白都如此。

目的蛋白可能缺乏功能活性所需的翻译后修饰。举例来说,绒毛膜促性腺激素就需要哺乳动物的糖基化修饰才具有活性。尽管昆虫细胞能提供糖基化修饰,但它们无法提供绒毛膜促性腺激素活性所需的特定糖基化。

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