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TALs

我们观察到只要有3 bp的错配便会影响TAL的结合。我们建议设计序列和结合位点之间精确匹配。如果您需要获得设计上的帮助,请发邮件到geneartsupport@lifetech.com

19 bp结合结构域对于核酸酶而言效果更好。结合位点不需要是相同长度;但是对于核酸酶而言19 bp结合结构域效果最好。

虽然我们的Invitrogen™ GeneArt™ Precision TALs要求在5’末端有一个T并且在正向和反向TAL效应子之间有13–18 bp的间隔序列以便Fok1核酸酶进行正常配对,但是Invitrogen™ GeneArt™ PerfectMatch TALs允许靶向基因组任何序列并且消除了5’末端要求为T的限制。另外,两个效应子之间的最佳间隔序列为 15–16 bp。

我们在TAL MCS入门载体中提供一个多克隆位点替代效应子结构域。这一设计使得您可以向其中插入任何蛋白编码序列,并且可以根据序列特异性将您得到的TAL蛋白靶向到基因组的任何位置。我们还提供基因合成服务以生成任何您没有模板的效应子结构域。

Invitrogen™ GeneArt™ Genomic Cleavage Selection试剂盒

可能的原因和建议如下:

原因

解决方法

单链(single-stranded, ss)寡核苷酸设计不正确

确保每条ss寡核苷酸均在5’末端包含用于克隆到GeneArt基因组切割筛选载体上的4个核苷酸:

正义链5’末端包含AATT

反义链5’末端包含CTAG

双链(double-stranded, ds)寡核苷酸被降解

将50nM ds寡核苷酸存储于1X寡核苷酸退火缓冲液中置于–20°C

避免反复冻融;将50nM ds寡核苷酸储存液分装并保存于–20°C

寡核苷酸退火反应效率过低

确保根据实验说明进行退火反应

如果环境温度>25°C,则需要在25°C温箱内进行退火反应。

这种情况发生的原因是:

  • 寡核苷酸设计不正确;请确保包含针对TALEN/CRISPR靶点的特异性序列
  • 转染效率过低;优化条件或使用Invitrogen™ Lipofectamine™ 3000或2000试剂以获得最佳结果
  • 细胞系不匹配;OFP在某些细胞系内表达不是很好;我们建议使用293FT细胞测试切割活性。

OFP背景过高可能是因为质粒污染,或者可能是细胞系或靶点原因造成的。在培养含有切割筛选质粒的细胞时,确保挑取单克隆,或者可以尝试降低转染时所用的载体量。

结果根据切割位点不同而不同。我们建议使用Invitrogen™ GeneArt™Genomic Cleavage Detection试剂盒(货号A24372)来确认对于内源基因组位点的切割。

Invitrogen™ GeneArt™ Genomic Cleavage Detection试剂盒

请看下表所列的常见问题、可能原因以及建议:

DNA条带表型

可能原因

建议

条带弥散

裂解物浓度过高

将裂解物稀释2至4倍然后重复PCR反应。

条带过暗

裂解物浓度过低

在PCR反应中使用2倍量的裂解物。不要在PCR反应中使用超过4 µL的裂解物。裂解物会抑制PCR反应。

不同扩增子之间条带亮度有差异

不同样本内裂解物浓度不同

使用 Invitrogen™ PureLink™ PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。欲比较样本间的效果并想获得最佳结果,请纯化PCR产物并在每个切割实验中使用相同量的DNA。每个反应使用50 ng至100 ng DNA已经足够。

无PCR产物

PCR引物设计不佳或模板包含GC富集区域

重新设计引物,使其长度为18–22 bp,GC含量45–60%,并且Tm范围在52–58°C。对于GC富集区域,向50 µL反应体系内加入1–10 µL的360 GC Enhancer 并重复PCR扩增。

请看下表所列的常见问题、可能原因以及建议:

问题

可能原因

建议

没有可见的切割条带

核酸酶不能到达目标序列或不能切割目标位点

转染效率过低

在临近的序列设计新的靶向策略

基因组修饰过低

优化转染实验方案

没有进行变性和退火步骤

使用试剂盒内的对照模板和引物确认试剂盒的成分和实验步骤。

分析凝胶数据遇到困难

检测切割条带受到背景的干扰

重新设计PCR引物以获得区分明显的切割条带图案

 

非特异性切割条带

目标位点有复杂突变。

酶切孵育时间过长。

加入了过多的检测酶。

检测酶对于某些目标位点的非特异性切割。

重新设计PCR引物以扩增目标序列。

使用假性转染或非相关质粒转染的细胞裂解物作为阴性对照以区分背景和特异性切割。

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