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为帮助您优化自己的实验,获得最理想的结果,我们在此针对您的研究需要,编制了一个涵盖常用注意事项和诀窍的资料库。

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反转录

反转录酶 优势 劣势
AMV(禽成髓细胞瘤病毒) 在55°C下具有活性 带有RNase H酶活性,影响全长cDNA的得率
M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒) 相对于AMV,RNase H活性较低 在温度超过45°C的条件下会失活
Thermoscript™ 高热稳定性(最高可承受65–70°C)
提高了易成二级结构RNA的得率
可产生更多的全长cDNA(较低的RNase H活性)
增强了引物结合特异性的AMV突变体
在-80°C条件下储存;存储不当时,会很快失去活性
SuperScript® II 较高的第一链cDNA得率
较高的全长cDNA合成率
具有TdT活性的M-MLV突变体
理想的温度是42°C;高温下不稳定。
SuperScript® III 具有最高的第一链cDNA得率
最高的第一链cDNA得率
具有最高的全长cDNA合成率
可使用较高的活性单位,不会抑制随后的PCR反应
相对于 SS II ,具有更长的热稳定性
在50°C具有活性的M-MLV突变体
 

MultiScribe™ 反转录酶(货号4311235)和MuLV反转录酶(货号 N8080018)基本上算是同一种酶,都属于重组莫洛尼鼠白血病病毒(MuLV)反转录酶。二者唯一的区别在于推荐的用途。MultiScribe™反转录酶推荐用于定量核酸分析,而MuLV则推荐用于传统的RT-PCR分析。

是的,我们的确供应 SuperScript® CellsDirect™ cDNA合成试剂盒,该试剂盒适用于单个细胞至10,000个细胞。此试剂盒还可用于冰冻切片激光显微切割(LCM)样品,但甲醛固定石蜡包埋的组织(FFPE)不能使用。此外,您还可使用我们的Ambion® Cells-to-CT™试剂盒,该试剂盒可自细胞裂解液直接进行RT-PCR扩增。这些试剂盒均与培养的细胞和LCM样品兼容。

SuperScript® VILO™ cDNA合成试剂盒含有SuperScript® III反转录酶和辅助蛋白的混合物,其中后者可以提高反转录反应的效率,进而提高得率。由于存在辅助蛋白,SuperScript® VILO™中的反转录在42°C条件下活化。

在-20°C非无霜冰箱储存时,M-MLV反转录酶、SuperScript® II反转录酶和SuperScript® III反转录酶可在2年内保持稳定。在4°C 条件下,这些酶可在48小时内不失活。但需要新鲜的DTT来维持活性。

SuperScript® III反转录酶最适温度是50°C,其适用的最高温度为55°C。在部分使用基因特异性引物的qRT-PCR反应中,您可以在60°C下进行反转录反应。SuperScript® II反转录酶最适温度是42°C,其适用的最高温度为50°C。M-MLV反转录酶最适温度是42°C。ThermoScript™反转录酶在60°C下表现出最佳的活性,其适用的最高温度可达70°C(适用于扩增子长度预计为1kb或更短的情况)。对于预期PCR产物长度超过1kb的情况,建议采用的最高的第一链合成温度为60–65°C之间。特别是当基因特异性引物配合使用热稳定性反转录酶的情况下,务必要保证您的第一链引物在较高温度下退火,。。用上述酶进行反转录时,若使用oligo(dT)引物进行第一链合成,我们建议使用oligo(dT)25。

不会,如果需要有TdT活性的酶,请使用SuperScript® II反转录酶。

SuperScript® III反转录酶(货号18080093、18080044、18080085)含有单独的酶,5 X第一链缓冲液和100 mM DTT。

用于RT-PCR的SuperScript® III第一链合成系统是一个完整的试剂盒,包含SuperScript® III反转录酶,以及从总RNA或poly(A)- RNA合成第一链cDNA所必需的其他成分,其中包含:

  • Superscript® III反转录酶
  • Oligo (dT)20引物
  • 随机六聚体
  • 10倍反转录缓冲液
  • 25 mM MgCl2
  • 0.1 M DTT
  • 10 mM dNTP混合物
  • RNAseOUT™ 重组核糖核酸酶抑制剂
  • 大肠杆菌RNase H
  • DEPC处理的水
  • HeLa细胞总RNA对照
  • 上游对照引物
  • 下游对照引物
注:此试剂盒不含PCR扩增酶。

建议使用酶附带的缓冲液。之所以出现这些细微的差异,是因为不同的试剂盒开发时间不同,并且很可能由不同的研发团队开发。

不会。在加入EDTA后, Mg2+:EDTA的摩尔比约为1:1。EDTA会与Mg2+按照1:1的摩尔比例进行螯合。因此RNA可以直接用于反转录。第一链反转录缓冲液的Mg2+终浓度通常为2.5mM。 如果反转录反应缓冲液中不含MgCl2,则可向反应体系中添加终浓度为2.5 mM 的MgCl2 。因此会使MgCl2的净终浓度约为2.25-2.5 mM。

可以从附着在Dynabeads®磁珠上的mRNA生成全长cDNA。我们建议您在此时采用热稳定的反转录酶试剂盒,以适应富含GC二级结构的难处理区域。即便如此,仍不可在实验开始时加热磁珠上的mRNA,因为这会造成mRNA洗脱(A:T碱基对是热稳定性最差的)。

我们内部曾以磁珠上的oligo(dT)25为引物,使用了ThermoScript™反转录酶。其中的cDNA合成过程依照说明书进行。在使用热稳定的反转录酶和oligo(dT)25引物进行第一链cDNA合成时,在进行建议的更高温度处理之前,必须先在50°C下进行5分钟的孵育。这是为了让cDNA合成至AT杂交区域之外以增加结合稳定性,从而确保mRNA不会从磁珠上脱落。最终的cDNA会共价结合到磁珠表面,且结合有cDNA的磁珠可用作多种杂交反应的模板。

此操作步骤(65°C下加热5分钟)的目的在于打开RNA中的二级结构。如果您希望将磁珠上的oligo(dT)25用作您的cDNA合成引物,生成连接在固相支持物上的cDNA,就可以忽略这一步。此时您可从50°C开始(否则mRNA会从磁珠上脱落),然后进入65°C处理步骤。

以下成分可单独购买:

  • Superscript® III反转录酶(货号18080093、18080044、18080085)
  • Oligo (dT)20引物(货号18418020)
  • 随机六聚体(货号48190011)
  • 10 mM dNTP混合物(货号18427013、18427088)
  • RNaseOUT™重组核糖核酸酶抑制剂(货号10777019)
  • 大肠杆菌RNase H(货号18021014、18021071)

可以。我们单独出售 的M-MLV反转录反应缓冲液(货号18057018),可以用于M-MLV反转录酶、SuperScript® II反转录酶和SuperScript® III反转录酶。

可以。我们的确单独出售随机引物,其货号为48190011。

是的,我们单独供应大肠杆菌RNase H酶,其货号为18021014和18021071。

这些酶均含有RNase H结构域,但是这些RNase H结构域都经过突变。在RNase H活性检测分析之中,我们未检测到任何RNase H活性。

以下试剂至少可将SuperScript® II反转录酶的活性抑制50%。

  • 34% 的甘油
  • 4 μg/mL的肝素
  • 0.0025%(w/v)的 SDS
  • 5%(v/v)的甲酰胺
  • 17.0%(v/v)的DMSO
  • 4 mg/mL的糖原
  • 30 mM的盐酸胍
  • 15 mM的异硫氰酸胍
  • 1 mM的EDTA
  • 2.5 mM的NaPPi
  • 0.4 mM的亚精胺

设置一组未进行反转录的RNA作为对照以检测特异性。如果这一RNA产生了PCR产物,其最可能由基因组DNA污染物产生。此外,可横跨两个外显子设计引物对,从而确保来自cDNA的PCR产物可以与基因组cDNA生成的产物在大小上有明显的区别。在设计引物时,也可以在跨越外显子/外显子的结合部位设计。这些引物不大可能以基因组DNA为模板扩增。使用DNase处理RNA时,建议使用扩增级DNase I(货号18068015)或等效的产品。

当然,为此我们提供了三种试剂盒:

  1. SuperScript® Plasmid System,适用于cDNA合成和克隆
    • 可生成cDNA并将其克隆到含有CMV启动子、兼容Gateway®的载体(pCMVSport6)之中,以便进行哺乳动物细胞表达筛选
    • 实验需要mRNA(必须具有poly(A)尾)作为起始材料
    • 可以在大肠杆菌中进行探针筛查,但不可进行表达筛查
    • 产生单向、包含Sal I / Not I酶切位点的dsDNA
  2. SuperScript® Choice系统,适用于cDNA合成
    • 适用于任何RNA来源
    • 可以使用随机引物、oligo(dT)引物或混合引物
    • 会产生带有EcoRI末端的cDNA,可以克隆到任何具有EcoRI 位点的载体(质粒或噬菌体)中
    • 有益于生成cDNA文库
    • 产生的dsDNA可双向克隆
  3. SuperScript®双链cDNA合成试剂盒
    • 可用于生成平端、双链cDNA
    • 可使用总RNA或mRNA作为起始材料

一步法RT-PCR相对方便,不易污染,且移液错误的机会较小。这种方法要比两步法速度更快。然而,这种方法生成的cDNA不可保存,而且每次只能分析少量的基因。两步法可以获得可保存的cDNA,同时可分析多种基因,具有较大的灵活性。

对于降解的RNA、含有严重的二级结构的RNA、无polyA尾的RNA或原核RNA,随机引物是最佳选择。随机引物仅推荐用于两步法RT-PCR,而且通常可以获得最高的得率,尽管cDNA可能不为全长cDNA。如希望通过两步法RT-PCR得到全长cDNA时,最好使用Oligo(dT)引物。这一反应受到二级结构和RNA质量影响。基因特异性引物应用于特异性基因的扩增反应,主要用于一步法RT-PCR反应。

这很大程度上依赖于样品的质量。mRNA占总RNA的1–5%。根据所用的引物和酶,反转录反应可以将>70%的RNA转换成cDNA。

有些人觉得,反转录之后形成的RNA:DNA双链之中的RNA会抑制PCR引物退火和扩增cDNA。使用RNase H-的突变体反转录酶时,RNA仍然存在。RNase H可以去除与cDNA结合的RNA。但另一方面,有些人认为95°C的变性步骤会造成RNA引物与DNA脱离,因而RNase H处理完全没有必要。因此这一步骤是可选的。在克隆较大的片段时,RNase H处理的做法较为有益。

cDNA合成所需的RNA模板量具有高度的灵活性,取决于可用的样品量和个人需求。通常情况下,1 μg总RNA可进行一次常规20-μL反转录反应。

具体的体积取决于用于第一链合成的起始RNA量,以及靶标基因的丰度。我们建议在50-μL的PCR反应中,以10%第一链合成反应的量作为起始用量,超过10%将会抑制下游反应。

采用不含RNase的DNase处理RNA可以将DNA的含量控制在检测不到的水平。我们建议使用我们的扩增级产品DNase 1(货号18068015)。

我们建议采用 Purelink® RNA Mini Kit (货号12183025)或TRIzol®试剂(货号15596026)来分离RNA。通常没有必要采用Oligo(dT)法选择性分离mRNA,尽管这能够提高特异性cDNA的得率。

建议您使用我们的ThermoScript™ 反转录酶,在如今市售的反转录酶之中,这种酶具有最高的热稳定性,可以处理您的较棘手模板(高GC含量或过多二级结构)。

该抑制剂可以防止在RNA准备过程中由于核糖核酸酶污染引起的靶RNA的降解。

如果在不含反转录酶的对照管/孔中生成扩增产物,必须从RNA样品中去除残留的基因组DNA。您可通过下述实验方案从总RNA中去除基因组DNA。

在冰上,将以下成分添加到无菌的 0.5 mL微量离心管中:

  1. 总RNA,最好小于或等于1 μg。(见下文注1。)
  2. 1.0 μL的10 X DNase缓冲液 (200 mM Tris, pH 8.3, 500 mM KCl, 20 mM MgCl2)。
  3. 0.1 U–3.0 U的DNase I(无RNase,货号18047019)或1.0 U的扩增级Dnase I,(货号18068015。参见下文注2。)
  4. 加入DEPC处理的水,将总体积加至10 μL。
  5. 在室温下孵育15分钟。(参见下文注3。)
  6. 加入1 μL 25 mM EDTA终止反应,并在65°C下加热10分钟。(参见下文注4。)
  7. 置于冰上1分钟。
  8. 通过短暂的离心处理进行回收。这样产生的混合物可直接用于反转录反应。

请留意以下注意事项:

  1. 如需处理更多的RNA,可线性放大整个反应体系。在10 μL的反应体系中,RNA不要超过2 μg。加入的RNA过多会导致溶液粘度增加,从而抑制DNase I扩散并找到DNA。
  2. 扩增级DNase I已经过充分纯化,去除了其他所谓的“RNase-free”酶制备过程后仍然残留的痕量核糖核酸酶的活性,不需要添加RNase抑制剂。
  3. 务必保证孵育时间不超过15分钟、温度不高于室温。温度过高或者孵育时间过长会导致RNA出现Mg2+依赖性水解。
  4. 这一步骤需要小心地吸取所有溶液,以确保二价的金属阳离子(Mg2+)的浓度能够得到有效控制。
  5. 由于DNase I必须加热到65°C来灭活酶,在加入EDAT之后,必须保证游离的二价金属离子浓度足够低(少于1 mM),以免RNA出现化学水解。另请参见下文的参考文献。

在加入EDTA后, Mg2+:EDTA的摩尔比例约为1:1。EDTA会与Mg2+分子按照1:1的摩尔比例进行螯合。因此,该RNA可直接被用于下游的反转录反应。加入第一链反转录酶缓冲液会使镁离子的终浓度为2.5mM。如果反转录反应缓冲液中不含MgCl2,则可向反应系统中添加MgCl2直至其终浓度达到2.5 mM。这样MgCl2的净终浓度约为2.25-2.5 mM。

RNA水解参考文献:
Molekulyarnaya Biologiya (1987) 21:1235-1241.
References on the mechanism of hydrolysis by other cations:
Eichorn GL and Butzov JY (1965) Biopolymers 3:79.
Butzov JY and Eichorn GL (1965) Biopolymers 3:95.
Farkas WR (1968) Biochim Biophys Acta 155:401.
第一篇论文的作者表达了这样一种观点,即由于阳离子引起的非特异性水解(通过2',3' 磷酸环化进行)类似于RNA剪接时发生的特异性水解。

RACE

RACE的含义为cDNA末端快速扩增技术。这是一种发现全长转录本的5′和/或 3′末端的方法。如果您所感兴趣的转录本的局部序列已知,可采用RACE技术获得完整的ORF、5′ UTR和3′ UTR序列。

在核查RNA的完整性时,对500 ng的RNA通过琼脂糖/溴化乙啶凝胶电泳方法进行分析。您可以使用常规的1%琼脂糖凝胶或者变性的琼脂糖凝胶。对于总RNA样品,您应观测到 28S和18S的 rRNA条带。 mRNA会形成0.5至12 kb的拖尾。 28S条带的强度应为18S条带的两倍。如果您上样的RNA不足,则28S条带可能显示为弥散状态。如果使用变性的凝胶,则rRNA条带会非常清晰且尖锐。28S条带对应于4.5 kb,而18S条带对应于1.9 kb。

如果您进行5′ 端或3′端RACE,则需要一条基因特异性引物;如果您同时进行5′ 端和3′端RACE,则需要两条基因特异性引物。引物应符合下述规定:

  • 50–70% GC含量,以保证具有较高的退火温度 (>72°C)
  • 长度为23–28核苷酸,以增加特异性结合
  • 3′段具有较低的GC含量,以便最大程度的降低DNA聚合酶在非特异性位点的扩增(在最后五个碱基中含有不超过两个G或C残基)
  • 引物中不含有自身互补碱基序列或不含与试剂盒附带的引物互补的序列,尤其是在3′端
  • 退火温度超过 72°C—使用高退火温度的引物有助于提升您的PCR反应的特异性

如果该反应能够得到特异性的产物且对照反应没能得出特异性产物,则您的条带很可能是真实的。唯一的确证方法是对产物进行测序。

如果该反应能够得到特异性的产物且对照反应没能得出特异性产物,则您的条带很可能是真实的。唯一的确证方法是对产物进行测序。

可变剪接或可变polyA位点以及可变的起始位点都会产生正常的多个条带。进行测序有助于帮助您解决不确定性问题。

以下为几条有助于您优化自己的RACE反应的建议:

  • 使用优质完整的RNA
  • 使用目标基因高表达丰度的RNA样品
  • 各个步骤上样量不要超过建议的量
  • 针对PCR反应优化退火温度
  • 加入推荐的对照

3′端RACE利用了mRNA中自带的poly(A)尾作为通用的PCR反应的起始位点。在这一操作步骤中,mRNA通过反转录酶(RT)和oligo-dT接头引物反转录成cDNA。特异性的cDNA随后通过PCR反应,采用基因特异性引物(GSP,退火到已知外显子序列的区域)和接头引物(靶向poly(A)尾区域)进行扩增。这样一来,即可捕获处于外显子和poly(A)尾之间的未知的3′-mRNA序列。

CIP酶不能识别三磷酸核苷酸。如果您的产物的末端具有除单磷酸基团之外的其他修饰,CIP均不会对其进行去磷酸化,而且在实验方案的后续步骤之中RNA连接酶也不会将RNA寡核苷酸结合到5′端三磷酸上。如果为了获得全长的带帽的信使RNA而遵照随附的实验方案操作,则不能从5′端三磷酸化的RNA材料获得任何产物。

接头引物(AP)、通用扩增引物(UAP)和精简的通用扩增引物 (AUAP)已经停产。其序列可见本手册第4页。

5’端RACE精简锚定引物 (AAP)、通用扩增引物(UAP)和精简通用扩增引物(AUAP)已经停产。其序列可见本手册第4页。

巢式PCR需要进行两轮扩增 – 第一轮扩增使用一套PCR引物,第二轮扩增则使用内部的“巢式”引物和1%或者更少的第一次PCR反应产物作为模板。当靶标丰度较低或同时产生特异性和非特异性PCR产物时,可以使用巢式PCR。如果序列信息只能在第一轮PCR产物的内部设计出一端的引物(如在RACE中),则需要使用半巢式PCR。

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