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反转录酶

以下列出了各种原因和我们提供的建议:

原因 建议
第一链cDNA合成过程中出错 请采用优质RNA作为对照,验证第一链反应的效率。
存在RNase污染 向样品中添加对照RNA,以判定在第一链反应体系中是否存在RNase。您可在第一链反应体系中使用RNase抑制剂。
RNA出现多糖共沉淀 采用氯化锂沉淀RNA,以便去除多糖,详见Sambrook等人所述。
靶标mRNA含有较强的转录停顿因子 在第一链合成中,使用随机六聚体引物替代oligo(dT),提高温度,使用靠近靶标cDNA 3′末端的PCR引物。
PCR使用的第一链产物过少 在50 mL PCR反应之中,至多可使用10%的第一链反应产物
第一链合成时使用了基因特异性引物 可以试试其他的基因特异性引物,或者改用 oligo(dT)。请确保GSP为反义序列。
存在反转录酶抑制剂 可在第一链反应之前,通过对mRNA进行乙醇沉淀来去除抑制剂。可以使用70%(体积比)乙醇洗涤mRNA沉淀。注:反转录酶抑制剂包括SDS、EDAT、胍盐、甲酰胺、焦磷酸钠和亚精胺。
RNA已降解 确认使用高质量和完整的RNA。
退火温度过高 视必要降低温度和/或使用降落PCR。

Please see the following causes and suggestions:

原因 建议
基因组DNA污染或者存在未知的剪切体 采用扩增级DNase I(货号18068015)预处理RNA。设计退火到内含子两侧的外显子序列的引物,或者退火到mRNA的外显子/外显子边界处的序列的引物,以便区分扩增的cDNA和潜在的污染物基因组DNA。如需检测产物是否来自于DNA,设置一组不进行反转录的RNA对照组进行PCR。
引物非特异性退火 改变PCR的退火条件。使用热启动PCR聚合酶。针对各种模板和引物组合优化镁离子浓度。
引物形成二聚体 设计3′ 端不含互补序列的引物。

cDNA得率低可能由不同的原因造成。以下列出了几条:

  • mRNA质量不佳:在变性凝胶上对总RNA进行观察,以确认28S和18S条带是否清晰明亮。OD 260:280比率应为1.7。
  • RNase污染造成模板降解:保持无菌条件。
  • 可能存在SuperScript II反转录酶的抑制剂:在第一链反应之前,通过对mRNA进行乙醇沉淀来去除抑制剂。加入70%(体积比)乙醇对mRNA沉淀进行洗涤的步骤。若需验证是否存在反转录酶抑制剂,可以在反应体系中加入1 μg的对照RNA比较第一链cDNA合成的得率。
  • RNA产物可能与多糖共沉淀:采用氯化锂沉淀RNA,纯化RNA。
  • 高估了mRNA的浓度:如有可能,测定A260,对mRNA浓度进行定量分析。
  • 如果使用32P同位素,其可能放置的时间太久:请使用时间不超过2周的同位素。
  • 酶的量不足:针对每μg RNA推荐使用200 U的SuperScript II反转录酶。
  • SuperScript II反转录酶的活性因反应温度不当而降低:请在37°C至50°C条件下进行第一链反应。
  • 第一链反应体系中未添加了DTT。
  • TCA沉淀操作不当 :在浸入液闪剂之前充分干燥GF/C滤网。
  • SuperScript II反转录酶存储不当。请在-20°C条件下储存,请勿在-70°C条件下储存。
  • 反应体积过大:反应应在小于或等于50 μL的体积下进行。

我们分析的原因和建议如下:

  • 第一链合成产物浓度过低:起始RNA的质量过低,反应体积过大,且/或引物浓度过低或引物未针对RNA正确退火。
  • 第二链合成产物浓度过低:未加入RNAse H,或者在进行第二链反应时进行了不当稀释。
  • 克隆数量过少:最可能是接头连接/磷酸化时出现问题;请使用phiX Hae III片段作为对照;为其连接接头并进行磷酸化处理,以判定这一环节是否存在问题。

RACE

我们分析的原因和建议如下:

  • 检查HeLa对照RNA:RNA降解或者 PCR或反转录反应失败都可能造成无RACE PCR 产物。
  • 您的基因丰度可能过低:请增加PCR循环的数目或者进行巢式PCR。
  • 您的基因未在这一组织中表达:通过两种GSP进行扩增,以便分析您的基因的cDNA是否存在。
  • 反转录反应未能生成您的基因的cDNA:采用随机引物或GSP(在尽可能靠近5’端的位置杂交)进行反转录反应;此外,您还可将随机引物和GeneRacer Oligo dT引物联用,以增加获得全长cDNA的几率。
  • cDNA模板对于PCR反应属于困难模板:优化PCR反应参数和/或反应缓冲液;降低退火温度;在PCR反应中使用5-10% DMSO以帮助扩增GC含量高的区域;尝试高持续合成能力、高保真度的PCR反应酶。
  • 在PCR反应后观测不到条带:试试其它退火温度。
  • RNA质量:在开始实验前,在琼脂糖凝胶上分析您的RNA样品。

形成RACE PCR假象或者非特异性的PCR条带的原因可能有如下几条:

  • GSP与其它cDNA非特异性结合,从而造成非相关的产物和所需的产物一同扩增。
  • GeneRacer引物与cDNA非特异性结合,从而形成了两端带有GeneRacer引物序列的PCR产物。
  • RNA降解。
  • PCR管或试剂被污染。

:假象可能由于未处在最佳的PCR反应条件造成,此类情况可通过阴性对照PCR鉴定出来。

取10-20个克隆集落进行分析,以确认分离出了最长的转录本。很多基因并不仅含有一套转录起始位点,而是有多个转录起始位点,而且这些位点有时候只跨几个碱基,有些时候可能跨上百个甚至更多个碱基。对RACE产物进行克隆,同时分析多个克隆集落,可确保您能够检测出您的基因中的多种异质性转录起始位点。此外,您可能得到非全长基因转录本的PCR产物。之所以可能会获得非全长信使RNA的PCR产物,是因为:

  • CIP反应之后RNA降解,而形成了带有5’端磷酸基团的非全长RNA,进而得以连接到 GeneRacer RNA寡核苷酸上。请务必谨慎处理,以确保RNA不会降解。
  • CIP去磷酸化不完全。请通过增加CIP的用量,或减少RNA量来解决。
  • PCR反应出现了PCR非特异性条带,未能得到真正的连接产物。请采用上述优化您的PCR条件。

以下为有助于获得最佳的实验结果的几点因素:

  1. 保证成功的关键因素是确保RNA的质量。RNA降解是未能获得正确的RACE产物的最可能原因。我们强烈建议您在开始实验前在琼脂糖凝胶上分析您的RNA样品,以确认RNA的完整性。使用RNaseOUT™ RNase抑制剂可以确保不同的酶促反应期间RNA的稳定性。如果您对RNA稳定性特别关心,可以在各个酶促反应(CIP、TAP和连接反应)之后使用琼脂糖电泳方法进行检测。在适当体积的酶促处理之后,采用DEPC水重悬RNA(参见 GeneRacer 试剂盒手册第7、9和11页),选取1 μL在琼脂糖上进行分析。与等量的未处理RNA进行比较,以检查降解情况。
  2. RACE PCR假象或者非特异性条带可能由于以下几点原因造成:
    • GSP与其他cDNA非特异性结合,从而造成非相关的产物和所需的产物一同扩增。
    • GeneRacer引物与cDNA非特异性结合,从而形成了两端带有GeneRacer引物序列的PCR产物。
    • RNA降解。
    • PCR管或试剂受到污染。

    注:假象可能由于未处在最佳的PCR反应条件造成,此类情况可通过阴性对照PCR鉴定出来。

  3. 如果可以看到 GeneRacer 5′ 端引物对照存在拖尾,我们的建议如下:
    • 使用其它5′ 端引物(所谓的GeneRacer 5′端引物)。与原引物相比,其与RNA寡核苷酸的结合位点略有差异,但相对于原始的5′ 端引物,其通常具有更低的背景。以下为GeneRacer 5′端引物的序列:5′ GCACGAGGACACTGACATGGACTGA。这一引物可在5′端RACE PCR之中,取代原始的5′端引物合成和使用。其应当能够降低RACE PCR的背景。
  4. 如果您使用5′ 端引物进行阴性对照实验时发现了拖尾,而另一阴性对照(无模板、含模板及GSP)表现正常,同时所有反应具有相同的PCR条件,那么:
    • 如果您使用5′ 端引物和模板时出现背景,则您应该从实际的RACE反应中去除这些条带/拖尾,以免与真实的RACE条带形成混淆。由于每一cDNA均具有该引物的结合位点,因而阴性对照之中始终存在这些拖尾。因此,这些拖尾现象不应成为主要关注的问题。如果实际上RACE PCR正常,则RACE条带的强度会超过拖尾背景。

巢式PCR如不经过优化,可能不产生条带,生成单条或者几条条带,或者出现混杂的条带(拖尾)。拖尾或扩增失败是由RNA质量不佳、RLM-RACE使用的RNA内缺少靶标造成。请务必使用纯净、优质的RNA作为您的起始材料。

  • 由于靶标基因具有多个起始转录位点或者引物同源性很高,可能会出现多条条带;您可以试试一套新的引物。如果您正在使用内部和外部基因特异性5′ 端RLM RACE引物(适用于巢式PCR),可试试在PCR反应之中将他们分别与基因特异性5′ 端引物配合使用,并等量稀释反转录反应产物作为模板。
  • 使用非TAP处理对照;非TAP处理的对照RNA应和您目前实验的RNA获得不同的PCR产物。由于RNA要么通过CIP脱磷酸,要么具有无法连接到5′端RACE接头的完整带帽结构,因此不会产生条带。
  • 优化PCR退火温度;外部PCR的退火温度不太关键,应保持在55–65°C;而内部的巢式PCR退火温度则可能需要更高,以便实现必需的扩增选择能力。如果PCR无法给出预期的结果,则可升高退火温度(试试提高2°C)再次试验。
  • 如果您的靶标较长,可以针对超过1kb的靶标延长扩增循环,每kb长度延长1分钟,
  • 如果您的RNA转录本之中含有高GC含量区域和/或其他具有稳定的二级结构的区域,可以试试升高反转录反应的温度,以便最大限度减少二级结构造成的影响。试剂盒中所含的M-MLV反转录酶可以在高至50°C的条件下使用。升高合成反应的温度,可能促进反转录酶通读。

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