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无细胞表达系统

  • 通过PCR或以质粒载体制备一个DNA模板
  • 纯化模板
  • 进行合成反应
  • 通过考马斯染色,免疫印迹等手段分析样品

无细胞表达系统非常适合于毒性靶标蛋白的表达,因为不需要依赖细胞就能获得蛋白。体外蛋白表达系统在单一反应管中利用必要的细胞学组份来驱动基因表达。

  • 过表达产物对宿主细胞的毒性
  • 表达产物不可溶,以及形成包涵体
  • 表达的蛋白被蛋白酶快速降解
  • 整合非天然或经修饰的氨基酸
  • 向蛋白中整合荧光探针
  • 需要对蛋白产物进行高通量分析

Expressway™小量无细胞表达系统经设计,能够胜任二十次50 µL反应或单次的1 mL反应。Expressway™大量无细胞表达系统足够200 x 25 µL形式的反应(通过2 x 96孔板来完成)。这两款产品均包含IVPS E. coli Extract(大肠杆菌提取物),IVPS反应缓冲液,补料缓冲液(feed buffer),10种氨基酸的混合物,甲硫氨酸,不含DNA酶/RNA酶的水,RNA酶A,T7酶混合物,2 mL反应管和一个阳性表达对照载体。货号为K990096的产品同时包含了pEXP5-NT/TOPO®和pEXP5-CT/TOPO®表达载体。

Expressway™ Lumio™系统将Expressway™无细胞系统和Lumio™技术的优势整合在一起。在使用Lumio™试剂盒的过程中,您的目的基因会与Lumio™标签融合在一起,这样就可在聚丙烯酰胺凝胶中灵敏和特异性地检测Lumio™-标记的融合蛋白,而无需进行染色或免疫印迹实验了。您也可通过标准的荧光计实时监控Lumio™-标记蛋白的合成情况。 

 

pEXP3-DEST(在K9900-70和V960-03产品中提供)通过Gateway®技术来将Lumio™和6xHis标签融合在目的蛋白的N端。
pEXP4-DEST(在K9900-90和V960-04产品中提供)通过Gateway®技术来将Lumio™和6xHis标签融合至目的蛋白的C端。

Lumio™识别序列是一条短小的6氨基酸序列:Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys。Lumio™检测试剂能够以高度的特异性和亲和力结合其识别序列,形成明亮的荧光信号,从而帮助用户开展实时的蛋白合成分析,或在凝胶中实现即时的蛋白检测。

Lumio™绿色检测试剂在500 nm处拥有最大激发效率,在535 nm处拥有最大发射效率。可使用装备了标准摄像头或可见光激光扫描器的标准UV透射仪来检测Lumio™融合蛋白。

尽管Lumio™标记蛋白可实现实时监测,但信号强度与蛋白表达水平之间并无相关性,因此我们推荐用户在实时监测之外补充凝胶检测。

 

使用丙酮来沉淀您的蛋白,以去除弥散的背景信号,之后加入Lumio™凝胶上样缓冲液(4X)和聚丙烯酰胺凝胶电泳专用的Lumio™凝胶检测增强剂(In-Gel Detection Enhancer)。

 

slyD是大肠杆菌的内源基因表达产物,富含半胱氨酸,因此能够与Lumio™检测试剂发生相互作用。

 

大肠杆菌,麦胚提取物(WGE),或兔网织红细胞裂解物(RRL)都适用于体外翻译。通常情况下,RRL能够有效翻译大于30 kDa的蛋白。WGE能够兼容任何尺寸的蛋白(包括那些15–30 kDa范围内的蛋白),尽管RRL系统可能对于大蛋白的翻译更有效。我们的Expressway™产品选用的是大肠杆菌。

  • 需通过T7启动子(而非T7lac启动子)驱动目的基因的转录。通常情况下使用T7lac启动子的得率会更低,因为由lacl基因编码的lac抑制子会对这一启动子的转录过程形成抑制作用。
  • T7终止子对于超螺旋质粒的高效体外转录过程是至关重要的。如果不含终止子,就会形成长链的非特异性RNA产物,后者会夺取dNTP并生成大量的焦磷酸盐。
  • gene10序列能够提升体外表达序列的稳定性。该序列会介导一种特异性茎环结构的形成;后者会稳定mRNA并增加翻译效率。 
  • (Trc载体中的)小型顺反子也能够通过编码一条小型基因产生一条短肽来促进翻译过程。由于这一元件能够将翻译机器引导至目的基因的起始位点附近,因此有助于下游系统的起始。
  • 我们推荐您以高拷贝数的质粒开始实验。这样,小抽所获得的质粒就可直接应用于Expressway™系统。
  • RBS与ATG之间的间隔距离对于高效的翻译过程十分重要。
  • RBS将增加蛋白得率并提升翻译保真度。

您可使用超螺旋的质粒DNA、线性DNA或PCR产物作为模板。为了获得良好的表达效果,所有的模板都须含有一个T7启动子,一个起始密码子,以及目的基因上游的原核Shine-Dalgarno核糖体结合位点(RBS)。如果您正在设计一款您自己的表达质粒,我们推荐您在DNA模板中加入以下元件:

  • 目的基因应置于一个T7启动子和一个核糖体结合位点(RBS)下游。目的基因需含有一个ATG起始密码子和一个终止密码子。
  • T7启动子上游最少应连接有6-10核苷酸(nt)的序列以辅助启动子实现高效结合(需要线性化的PCR产物)。这一序列应具有广泛的兼容性。
  • T7启动子下游应连接不小于15-20 nt的序列,以形成Studier等在1990年所描述的潜在茎环结构。
  • RBS与ATG起始密码子之间应有7-9 nt的序列,来帮助获得目的基因最优的翻译效率。这一序列应具有广泛的兼容性。
  • 目的基因下游4-100 nt处应包含T7终止子,来提高转录终止的效率和信使RNA的稳定性。

这两种载体均含有T7启动子,RBS和T7终止子,这些序列的设定都针对Expressway™系统中的高水平蛋白表达应用进行了空间和序列上的专门优化。pEXP5-NT/TOPO®载体的N端肽段中包含了6xHis标签和TEV识别位点,这样用户所构建的重组融合蛋白就能够实现简单检测和纯化。pEXP5-CT/TOPO®载体的C端包含了6xHis标签,来帮助用户构建能够简单检测和纯化的重组融合蛋白。蛋白得率可能显著依赖于目的重组蛋白融合标签的连接位置(N端或C端),因此,用户最好能够对两种质粒都进行测试。

否,我们不推荐您这样做,因为我们发现此类操作会抑制蛋白合成反应。相反,您可使用商业化的DNA纯化试剂盒(如我们的PureLink® HQ小量质粒纯化试剂盒或CsCl密度梯度离心法来纯化您的DNA模板。

我们观察过两种蛋白:一种在天然的大肠杆菌中完全不能溶解,另一种在大肠杆菌中只能部分溶解。对于这两种蛋白,使用Expressway™系统我们都至少观察到某些可溶性蛋白的生成。在这些案例中,Expressway™系统的确在某种程度上提升了蛋白产物的溶解度。不过,体外合成蛋白并不会彻底改变蛋白的溶解性质。

是的。我们推荐您以高拷贝数的质粒开始实验。这样,研究人员就可直接凭借小抽试剂盒的产物开展Expressway™反应了。许多pET载体都是低拷贝载体,在应用于体外翻译系统之前需要进行浓缩操作。

不是的,这些大肠杆菌菌株并非源自supF或supE大肠杆菌菌株,这些抽提物的抑制子活性极低。因此,本系统很适合于引入修饰氨基酸的操作。

某些Invitrogen™ pET载体在本系统中工作得很好;不过由于其中T7lac启动子的存在,其最终得率可能会比其他载体低一些。即使反应体系中加入了IPTG,lac抑制子也会与lac操纵子位点相结合,并对表达过程形成干扰。载体的最佳选择为pEXP-DEST载体,pEXP5-TOPO®载体和pRSET载体。除T7启动子之外,这些载体还包含了一段能够提升翻译效率的基因序列。

这些Gateway®兼容型载体均含有一个T7启动子和一个T7终止子。pEXP1-DEST载体含有一个核糖体结合位点(RBS)。如果您的基因含有RBS序列,或RBS是入门载体的一部分,就可选用pEXP2-DEST(其中不含RBS序列)。此外,pEXP1-DEST拥有N端的6xHis-Xpress融合标签,而pEXP2-DEST含有C端的V5-6xHis融合标签,这些标签序列都能够帮助用户方便地实现重组蛋白的检测与纯化操作。

否,这些抽提物中不含糖基化修饰元件。

标准的反应时间为2小时。不过,将此时间增至4小时能够提升蛋白得率。对于低溶解性的蛋白而言,这一延长的孵育操作可在室温进行。

对于筛选反应而言,标准的体积为100 µL(50 µL初始反应体积 + 50 µL 补料缓冲液),不过这一反应体系可按比例缩减至25 µL或扩容至2 mL的体积。请注意,蛋白得率可能在很大程度上依赖于其天然性质和所用模板。

为了获得最佳的蛋白得率,在孵育时间段内对反应体系进行彻底混匀是至关重要的。我们推荐用户使用1200 rpm的恒温混匀仪或300 rpm的振荡孵箱。请勿使用烘箱或水浴锅一类的静止孵箱,使用这样的设备会使蛋白得率降低30-50%。

我们推荐在30–37°C温度区间内孵育蛋白合成反应体系。最佳的反应温度依赖于重组蛋白的溶解性,需根据实际经验来确定。更高的温度(即37°C)一般有助于获得更高的蛋白得率;不过较低的温度(即30°C)通常有助于获得更好的蛋白溶解度。

您最短可在加入补料2.5小时后获得目的蛋白(一共3小时)。很多反应在3小时的时间内能够合成80-90%的总蛋白。不过,如需获得最高得率,我们推荐您将反应体系一共孵育6小时。

此外,在蛋白合成反应起始后的30分钟时间点添加1/2的补料缓冲液,之后在起始的2小时时间点再加入1/2的补料缓冲液,可能获得更高的蛋白得率。

本试剂盒中的甲硫氨酸是单独提供的,这样您就可在重组蛋白中整合非天然氨基酸,也可在蛋白合成反应中调整氨基酸的浓度。基于您的具体应用,您可以选用以下类型的非天然氨基酸:

  • 放射性标记的甲硫氨酸:在表达与纯化研究中使用35S-甲硫氨酸生成放射性标记蛋白。请参见使用手册第21页中的“开展蛋白合成反应”部分中关于标记型与非标记型甲硫氨酸的推荐用量。
  • 重金属标记的甲硫氨酸:使用硒代蛋氨酸(Budisa等,1995; Doublie,1997;Hendrickson等,1990)来生产标签蛋白,并将其应用于X射线晶体学研究。请参见使用手册第21页中的“开展蛋白合成反应”部分中关于标记型甲硫氨酸的推荐用量。注意:选用硒代蛋氨酸时,请勿在蛋白合成反应过程中使用任何一种非标记型甲硫氨酸。

在配制蛋白合成反应体系的过程中:

  • 如需使用35S-甲硫氨酸生成放射性标记的蛋白,请使用2 μL 35S-甲硫氨酸和1 μL 75 mM非标记型甲硫氨酸。
  • 如需使用硒代蛋氨酸来生成标记蛋白,请只使用2 μL硒代蛋氨酸;请勿添加非标记型的甲硫氨酸。

大肠杆菌细胞中的确含有一些能够辅助蛋白折叠的伴侣蛋白分子。不过,抽提物中并无额外添加伴侣蛋白。

否。本系统中并不会形成二硫键。不过,用户可添加碘乙酰胺来促进二硫键的形成(Biotechnol Bioeng 2004, 86(2):188–195)。推荐在室温下使用3mM 碘乙酰胺与抽提物预孵育30分钟。反应体系中已包含了1mM DTT(相当于2mM巯基);因此,1mM 碘乙酰胺就已过量。

我们实际上未曾使用His标签对抽提物中的蛋白进行过纯化。不过,这一操作是可行的,特别是在变性条件下。

我们没有针对此问题进行过专门测试,然而我们知道tRNA会成为限制因素。基于此种原因,简单加入特定种类的氨基酸不会对表达反应有什么帮助。

否,遗憾的是这些抽提物中不含糖基化修饰元件。

如果有必要,我们推荐用户在Expressway™反应起始阶段向体系中加入PMSF(终浓度为0.5-1.0 mM)。最好使用异丙醇而非乙醇来溶解PMSF,因为乙醇对蛋白合成效率会造成不良影响。您也可在转录/翻译反应过程中使用Pafablock C(AEBSF终浓度为0.1–0.2 mM)。这两种物质均为丝氨酸蛋白酶抑制剂。

蛋白合成反应结束后可通过多种方式分析您的样本,包括:考马斯亮蓝蛋白凝胶染色分析,免疫印迹分析,酶活分析或亲和纯化(如有可用的亲和标签)。如果您计划使用聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析样本,您可首先以丙酮沉淀蛋白的操作来去除弥散背景。 使用手册第22页中提供了丙酮沉淀及其他通用性的凝胶电泳方案。

膜蛋白

是的,我们提供了MembraneMax™蛋白表达试剂盒,该产品将全新的膜蛋白增溶技术与Expressway™系统相结合,在单一可扩容反应体系中以DNA为模板进行可溶性膜蛋白的体外表达操作。  

HN意指His标记的NLP。如果您希望表达天然状态(未标记)的膜蛋白,或希望使用6xHis之外的标签,我们推荐您使用MembraneMax™ HN试剂盒。如果您希望表达N端或C端融合了多聚组氨酸的膜蛋白,我们则推荐您使用MembraneMax™蛋白表达试剂盒。

请参见下表:

如果您需要表达的构建载体含有... 则使用... 并基于...进行纯化
N端多聚组氨酸标签 仅可使用MembraneMax™试剂 镍螯合层析(如ProBond™或NiNTA纯化系统)
C端多聚组氨酸标签 使用MembraneMax™试剂,或在多聚组氨酸标签的上游插入了终止密码子时使用MembraneMax™ HN试剂 镍螯合层析
GST标签 MembraneMax™试剂或
MembraneMax™ HN试剂
镍螯合物或GST亲和层析,或以两种方式串列纯化

NLP是直径在10 nm左右的圆盘状颗粒,通过一种专利配方形成的支架蛋白环包被的平面DMPC脂质双分子层。

可应用下列DNA模板:

  • 超螺旋的质粒DNA(推荐在需要最高得率的情况下使用)
  • 线性DNA
  • PCR产物

请注意,为了获得良好的表达效果,所有的模板都须含有一个T7启动子,一个起始密码子,以及目的基因上游的原核Shine-Dalgarno核糖体结合位点(RBS)。
此外,pEXP1-DEST,pEXP3-DEST,pEXP4-DEST,pEXP5-NT/TOPO®和EXP5-CT/TOPO®载体,以及其他任何适用于多聚组氨酸标签蛋白表达的载体系统,都必须使用MembraneMax™蛋白表达试剂盒,而不能选用MembraneMax™ HN蛋白表达试剂盒。请参见使用手册第6页中的详细信息。任何包含C端多聚组氨酸标签的载体,包括pEXP4-DEST和pEXP5-CT/TOPO®,仅在以下条件适用于MembraneMax™ HN蛋白表达试剂盒:

  • 不使用多聚组氨酸标签进行膜蛋白纯化,或
  • 表达载体中的目的膜蛋白基因与多聚组氨酸标签序列之间以终止密码子相隔。

您可通过多种手段来纯化DNA模板,如商业化的DNA纯化试剂盒或CsCl密度梯度离心法等。请勿使用凝胶纯化法来制备模板,因为源自琼脂糖凝胶纯化得到的DNA溶液会对蛋白合成反应造成明显的抑制效应。请参见使用手册 第12页,以获得更多详细信息。

可向反应混合物中加入下列试剂以增进溶解:

  • Triton X-100 (0.5–1%)
  • 十二烷基 - 麦芽糖苷(0.025–0.05%),CHAPS(0.1–2%)
  • 辛基葡糖苷(1-2 mM),Brij35(0.5-0.1%)
  • 辛基吡喃葡萄糖苷(1-1.5%)

最低的孵育温度为25°C,因为24°C是MembraneMax™试剂中DMPC脂质双分子层的转换温度。

我们研发部门的实验室报告称,通常情况下超螺旋质粒能够提供最高的蛋白得率。不过,线性化载体在以下条件下工作得也很好:

  • 它们包含正确的启动子,间隔序列,核糖体结合位点,ATG和终止子序列。
  • 也可将纯化的PCR产物(2–3 µg DNA纯化产物)用于表达操作。
  • 不可使用凝胶纯化来源的线性化载体

最重要的建议是确保您的反应体系在孵育阶段得到彻底的混匀。我们推荐用户使用1200 rpm的恒温混匀仪或300 rpm的振荡孵箱。请勿使用静止型的孵箱,这会使蛋白得率降低30-50%。此外,蛋白合成反应的孵育应在30–37°C的温度区间内完成,更高的温度通常有助于获得更高的蛋白得率。最后,使用2小时以上(可长达4小时)的孵育时间将有助于提升蛋白得率,尽管这可能会导致形成多分散胶团和蛋白降解。  

通过原子力显微镜观察到的微粒厚度为5 (± 0.5) nm,直径为10 nm。 

pEXP5-NT/CALML3载体用于表达N端标记的人源CALML3蛋白。pEXP5-CT/bR载体用于表达细菌视紫红质(bR)。在辅助因子,全反式视黄醛,存在的条件下,bR可作为膜蛋白表达的阳性对照,通过比色对照分析实现测定。这一对照分析系统通常可与膜蛋白合成反应平行进行,从而指示MembraneMax™蛋白表达试剂盒的组件的正常工作情况。在辅助因子存在的条件下,正确折叠的功能性bR的成功表达能够在大约15分钟时间内使反应混合物从淡黄色变为粉色。如果未观察到这一变色反应,您可尝试表达CALML3,以帮助分析和解决相关的实验问题。

CALML3融合蛋白阳性表达,而比色分析结果呈阴性,提示MembraneMax™试剂发生了降解,而缺乏CALML3蛋白表达则表明是Expressway™表达模块中的试剂发生了降解。

在100 μL蛋白合成反应体系中使用1 μg模板DNA(质粒或线性化DNA)。对于2 mL的反应体系,使用10-15 μg的模板DNA。如需获得最佳结果,请在使用前对DNA模板进行纯化。

在辅助因子,全反式视黄醛,存在的条件下,成功表达且正确折叠的功能性细菌视紫红质(bR)能够在最短15分钟时间内使反应混合物从淡黄色变为粉色。更长的孵育时间(2小时乃至更长时间)会产生更多的bR和更强烈的变色效应。  

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