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无细胞表达系统

Please review the following suggestions:

  • 检查您的载体序列(ATG起始密码子,读码框的一致性,等等)。
  • 如果您的载体包含N端或C端标签,这些序列可能会影响RNA结构和降低翻译水平。可尝试去除融合标签或其他末端序列。
  • 请确保DNA模板的纯度,且不含酒精、钠盐、乙酸铵或RNA酶等污染物。
  • 不要使用琼脂糖凝胶中纯化出的DNA,它们会抑制表达反应。
  • 我们推荐您在2 mL的蛋白合成反应体系中使用10–15 µg的模板DNA。如果您表达的蛋白分子量较大,则可将蛋白合成反应中的DNA模板用量增至20 µg。
  • 请确保使用恒温混匀仪或带有振荡功能的孵箱来进行反应,请勿使用不带振荡功能的孵箱或水浴。
  • 多次补料有助于提升蛋白得率。在蛋白合成反应起始后,您可通过更频繁地以小体积多次向样本加入补料缓冲液(feed buffer),来代替在反应初始阶段的30分钟时间点进行一次性补料的操作(即在3小时的时间内,每隔45分钟就向1 mL样本总加入0.25 mL补料缓冲液)。

您可在蛋白合成阶段尝试降低孵育温度至25–30°C。此外,也可向反应体系和补料缓冲液中加入温和的去垢剂(如至多0.05%的Triton-X 100,0.025%的十二烷基麦芽苷钠,0.1% CHAPS或0.05% Brij-58)。您也可尝试向反应体系中加入分子伴侣。

蛋白得率通常随着蛋白分子量的增加而减小。您可于蛋白合成阶段尝试降低孵育温度至25–30°C。

如果您的对照组反应未生成蛋白,则可能是试剂丧失活性或受RNA酶的污染。请检查储存条件和试剂的保质期。请小心进行Expressway™大肠杆菌slyD-Extract,Expressway™ 2.5X IVPS大肠杆菌反应缓冲液和Expressway™ 2X IVPS补料缓冲液(Feed Buffer)的冻融操作。一或两次的冻/融循环是可行的,但应避免多次冻融循环。

  • 您的蛋白可能未正确折叠——请尝试在蛋白合成过程中将孵育温度降低至25°C。
  • 您可能需要对蛋白进行翻译后修饰———Expressway™系统不会为重组蛋白进行翻译后修饰。
  • 您所合成的蛋白可能需要辅助因子才能发挥全部活力——因此请尝试在合成反应中加入所需的辅助因子。

这种现象可能由多种原因所导致。最常见的原因包括:蛋白酶解,DNA和/或RNA模板的降解(截短型的模板将生成截短的蛋白产物),内部启始(如果基因内部含有多个甲硫氨酸和RBS类似序列,核糖体就有可能在错误的甲硫氨酸位点启始翻译过程),提前终止,翻译暂停,过于频繁地应用罕见密码子,复杂的二级RNA结构,等等。蛋白变性时间过长,或1X SDS-PAGE样品缓冲液中加入的SDS不足,也可能会发生这种现象。

样品弥散情况可能由以下原因所导致:

  • 未使用丙酮来沉淀样本——使用丙酮来沉淀蛋白将帮助去除背景弥散情况。
  • 蛋白上样量过多——减少蛋白样品的用量。
  • 凝胶自身不够干净——在胶片曝光之前对凝胶进行简单的润洗
  • 蛋白合成反应中包含乙醇——请确保在DNA纯化过程中去除了残留的乙醇。
  • 检查预制胶的保质期——请勿使用过期的凝胶产品。

我们推荐您使用T7 RNA聚合酶(货号18033019,50 U/µL)。请在50 µL反应系统中使用1–1.5 µL本产品。

很抱歉,这样的操作会导致产品失活。

膜蛋白

请参见以下建议:

  • 请检查您DNA模板的构建(ATG起始、标签、终止密码子、阅读框等等)。
  • 请确保DNA模板的纯度。
  • 请勿通过凝胶纯化法来抽提您的DNA,使用这样的DNA会抑制蛋白合成反应的进行。
  • 请确保使用正确的DNA模板用量;我们推荐您在2 mL蛋白合成反应中使用10–15 µg模板DNA。
  • 请使用恒温混匀仪或带有振荡功能的孵箱进行蛋白反应。
  • 请确保使用正确剂量的MembraneMax™试剂。
  • 尝试不同的“补料(feed)”时间表——例如在蛋白合成起始30分钟和1个小时的时候,向样本中加入1/2体积的补料缓冲液(即向50 µL样本中加入25 µL补料缓冲液)。
  • 如需表达较大的蛋白,请尝试在合成过程中将孵育温度降至25–30°C。
  • 蛋白可能发生降解;将孵育时间限制在2小时之内,并在反应步过程减少操作步骤。

是的,您可将孵育时间延长至4小时以尝试增加蛋白得率,不过这一操作也可能导致形成多分散的胶团结构。由于两小时的孵育时间通常就能在多种蛋白上获得75%以上的表达效率,因此通常并不必要使用更长的孵育时间。您可尝试通过提升孵育温度来增加翻译速度,或通过降低温度来为蛋白正确折叠提供更长的时间。注意,请勿将温度降低至24°C以下,这是MembraneMax™试剂中DMPC脂质双分子层的转变温度。对补料时间表进行调整可能有助于提升您的合成反应效率。举例来说,您可尝试以50%的反应体积来起始反应,之后以30分钟的间隔两次加入25%反应体积的补料缓冲液。最后,您可按比例增加反应体系,以获得更大量的膜蛋白,因为蛋白得率通常是反应/体积依赖的。

全反式视黄醛可能被漂白;请确保所有的全反式视黄醛都保存在暗处,因为该物质的光稳定性不佳。

不正确的蛋白折叠会导致低蛋白活性。请尝试在蛋白合成阶段将孵育温度降至25°C。此外,您蛋白的翻译后修饰可能是蛋白表达活性所必须的。Expressway™ 大肠杆菌slyD-Extract并不会引入这些修饰(如糖基化或磷酸化)。最后,合成蛋白可能需要辅助因子的参与才能表现出全部活性。请确保在蛋白合成反应中加入了所需的辅助因子。

源自MembraneMax™试剂的支架蛋白在SDS-PAGE凝胶中呈现为28 kDa左右的条带。

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