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我们提供了MembranePro™功能性蛋白表达系统,来用于哺乳动物细胞膜表面蛋白——包括G蛋白偶联受体(GPCR)——以水溶性形式的表达和展示。 这一系统使用病毒样颗粒来捕捉细胞膜表面的脂筏区域,因为VLP会从细胞的这一区域分泌出来。通过使用这一系统,用户可将内源性或过表达的GPCR及其它细胞膜表面蛋白在其天然环境下捕获和展示,再将其用于下游分析。由于VLP是由细胞完成包装并分泌至培养基中的,因此用户可通过简单地倒出和澄清培养基,再沉淀分离VLP,来实现功能性膜蛋白的分离。相比制备细胞膜组份的操作而言,这一实验能大大节省时间,精力,并降低设备需求。由于VLP能够捕获细胞膜表面的受体富集区,您的GPCR相比细胞膜的粗提操作得到了大幅的富集。

MembranePro™功能性蛋白表达系统有两种标准的产品配置:MembranePro™功能性蛋白表达试剂盒(Functional Protein Expression Kit,货号A11667),以便利的完整试剂盒形式提供,包含了10次反应的所需的全部试剂;MembranePro™功能性蛋白支持试剂盒(Functional Protein Support Kit),包含膜蛋白功能性表达所需的相关试剂,但未含293FT宿主细胞或表达载体克隆模块。MembranePro™功能性蛋白支持试剂盒有三种规格:10次,60次或600次反应(货号分别为A11668、A11669、A11670)。

如需在Exp293F™细胞中高表达功能性膜蛋白,我们还提供了Expi293™ MembranePro™ 表达系统(货号A25869,A25870),这款产品将Expi293™的扩展性/易用性与MembranePro™技术整合起来,能够将膜蛋白的表达效率大大提升,进而超出常规贴壁培养的MembranePro™功能性蛋白表达系统的表达效率20倍以上。请参见应用说明了解更多详情。

注意:Expi293F™细胞(货号A14527)与pEF6 V5 His TOPO®表达载体试剂盒(货号K961020)未包含于Expi293™ MembranePro™表达系统中,因此需单独购买。

未含。不过,您可于离心后通过肉眼观察管底沉积的MembranePro™病毒颗粒。您也可通过受体-配体结合研究来测试MembranePro™病毒颗粒的功能。 

尽管您可测试其他的表达载体和启动子,不过我们还是建议使用pEF6 V5-His TOPO® TA表达载体来优化蛋白得率,因为这些试剂盒的性能曾针对包含EF-1α启动子的表达载体进行过专门优化。 

尽管您可测试并使用其他细胞系,不过我们还是推荐您使用Expi293F™细胞来获得最高得率,因为这些试剂盒的性能(即,使用ExpiFectamine™转染试剂所获得的转染效率)曾针对这一细胞系进行过专门的优化。 

理论上这是可行的,但我们未就这一方法进行过验证。假设细胞系已经表达了足够的GPCR蛋白,且通过了传统的膜蛋白制备成功进行了功能验证(即,受体-配体结合实验),您可使用MembranePro™功能性蛋白支持试剂盒(货号A11668,A11669,A11670)来生成MembranePro™病毒颗粒。GPCR的蛋白得率主要基于稳转细胞系的表达水平。 

pEF6 TOPO® TA载体的C端附加了His标签,这一位点不具有功能性作用。只有当您构建的序列中不含终止密码子时,His标签才会表达并用于纯化操作。本载体的N端不含His标签。 

我们表达和测试的GPCR在50 kDa左右。理论上,蛋白的胞外域或跨膜域没有大小限制。不过,如果C端结构域过大,则可能会遇到包装方面的问题。 

除非您解离MembranePro™颗粒,否则gag蛋白无法被除去。我们建议您使用那些能够减少gag的膜蛋白分离法。本系统能够产生可定量分析的蛋白量,每次反应得到50-500 μg总蛋白,其中GPCR只占一个较小的部份。 

如果配体结合链是被单独转染的,则可能无法与G蛋白相偶联。我们证实了激动剂对MembranePro™颗粒所捕获5HT1a和毒蕈碱M1受体的配体结合效果。基于亲和力的差异,不同的激动剂竞争性地占据了MembranePro™颗粒上的全部5HT1a和毒蕈碱M1受体,这提示MembranePro™颗粒所捕获受体仍能胜任生理性的相互作用。在直接结合研究中,激动剂以低亲和力形式(更高的Kd值)进行结合,提示G蛋白极少或未能与受体相偶联。不过,这一结合仍是特异性和竞争性的。您可通过共转同源的G蛋白来增加结合效力。

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