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概述

提供,我们提供预制板形式的靶向人类全基因组和不同功能类别基因的Silencer Select文库,以及客户定制 Silencer Select siRNA文库服务。

我们还提供靶向人和小鼠的Silencer 文库,以及客户定制 Silencer文库服务。

是的,siRNA文库可以以96孔板或384孔板形式订购。siRNA文库可以靶向任意数量的基因,例如,整个基因组,一个基因家族,一个生物学通路,或是客户定制的一组基因。

有许多的方法可用于准备siRNA板,而且每个用户可能有特定的要求。这些特定的需要可能决定您将用何种方法使用您的siRNA文库。最好先确定您操作文库的策略,并在重悬储存板前回答以下问题:

1. 您会为您的文库准备一个备份吗?注意,这样会需要双倍的冻存空间及塑料制品、枪头和密封锡箔用于备份储存siRNA文库,但是您需要一个备份以防万一。

2. 您会在初次重悬siRNA储存板时制备工作或者筛选板吗?如果不会,请将板紧紧密封。siRNA文库储存液能在–20摄氏度或更低温度的非自动除霜冰箱内长期储存。

3. 如果您在重悬时制备工作或者筛选板,您会制备多少筛选板拷贝?您有足够的冰箱空间储存这些拷贝吗?

4. 在筛选板内您会使用多大终浓度的siRNA?您会使用什么转染试剂?您会使用什么细胞类型?在大多数情况下,对于大多数永生贴壁细胞系(如HeLa和U2OS细胞系),Silencer siRNA文库可以用30 nM筛选,Silencer Select siRNA文库可以用5 nM筛选。为获得最佳效果,应用特定的siRNA在选定的细胞中进行转染优化实验来确定筛选板上siRNA的最终浓度。

我们的研发团队使用:

96孔板,Axygen 货号PCR-96-FS-C,96孔全裙边(Full Skirt)PCR微孔板

384孔板,Axygen 货号P-384-120SQ-C,120 µL 384深孔“Diamond Plate”方孔透明微孔板。

http://www.axygen.com/core_products/384-square-deep-well-plate-120ul

  • 合成正确性:使用MALDI-TOF质谱法测量每个单链RNA寡核苷酸样品的质量,并与计算出的质量进行比较。
  • 退火:使用非变性凝胶电泳对一个退火的siRNA样本进行分析

我们通过流程控制和经验证的仪器量取寡核苷酸。而且,运输前也会对每个板进行目测检查。

请访问我们的转染支持中心查找转染相关技术资源、技巧和诀窍,以及问题排查信息。

操作和储存

储存板是原始的重悬的siRNA,通常订购目的是便于长期储存siRNA文库,其浓度范围为1到10 µM。siRNA工作板是中等浓度的siRNA用于制备siRNA筛选板从而用于细胞培养及siRNA筛选实验。它们的浓度范围一般介于50至200 nM之间。siRNA筛选板通常是含有特定量的siRNA的组织培养板,适用于RNAi筛选方案。它们浓度通常是每小份体积(<20 µL水)中含有0.5–2.5 pmol的siRNA。转染试剂和细胞直接加入筛选板进行反向转染。

我们推荐重悬后的siRNA浓度≥1μM。

请参阅下述方案在板内重悬Silencer及Silencer Select siRNAs(以干粉形式提供):

1.     对每个板进行低速离心(最大速度 4,000 x g),以使所有内容物在开封前集中到板底。

2.     小心开封。为避免胶水粘在板上,您可能需要在板仍然冷冻时(–20°C或–80°C)打开封膜。

3.     加入无核酸酶的灭菌水,使用排枪或液体操作系统和无菌枪头,重悬至所需浓度(通常2–10 μM)(见下表)。

4.     小心吹打5次以重悬,并在室温至少孵育10分钟以充分溶解。

5.     如有必要,简单离心以使液体集中到板底。

6.     将siRNA分装到一个或多个siRNA工作板中以减少反复冻融。应当注意记录冻融次数。

7.     在存储前将新的无菌封膜(如Axygen货号 PCR-AS-200)封在板上。

8.     存储在非自动除霜冰箱的–20°C或更低温度以进行长期保存。siRNA可以短期存储于4°C,但是应当注意封好以避免蒸发。

我们建议重悬后siRNA浓度≥1 μM;10 μM最适合长期存储。使用下表作为重悬siRNA文库的指南:

干粉siRNA量

加入的无核酸酶灭菌水量

所需siRNA储存板浓度

 

1 µM

10 µM

0.1 nmol

25 µL

10 µL

0.25 nmol

62.5 µL

25 µL

1 nmol

***

100 µL

*** 体积超过管容积

文库储存板通常重悬后浓度>1 µM并存储于–20°C或更低温度。最适的保存浓度是10 μM。

对于Silencer siRNA,我们建议将冻融次数限制在10次以内以获得最佳结果。

对于Silencer Select siRNA,我们建议将冻融次数限制在50次以内以获得最佳结果。

一旦您准备好了所有需要的塑料耗材和稀释剂,就可以将siRNA分装到适合进行RNAi筛选实验的无菌组织培养板中。我们建议您将siRNA以液滴的形式分装到无菌培养板的工作表面,然后立即密封并将板保存在–20°C以降低污染或者过度蒸发的风险。siRNA的蒸发将导致其难以和转染试剂形成复合物从而降低转染效率。如果您在操作中观察到过度蒸发的现象,您可以在分装时降低siRNA浓度,增加每个孔分装的液体的体积从而减少蒸发的影响。在大多数情况下,保证96孔板内有20 μL siRNA或384孔板内有10 μL siRNA就可以满足大部分细胞和转染试剂的要求。

建议不要反复冻融工作或筛选板。您可以将密封良好的板短期保存在4°C不长于一个星期,使用时简单离心以使液体集中于管底。工作和筛选板中的siRNA浓度要远低于存储板,因而更容易在反复冻融中降解。要获得最佳结果,仅当您需要加入转染试剂和细胞进行RNAi筛选时再融化筛选板。

Ambion siRNA文库以干粉形式在室温运输。尽管干粉siRNA非常稳定,但是我们建议您在使用前都将干粉siRNA存储在–20°C(或更低温度)。

长期存储应将其存储在非自动除霜冰箱的–20°C或更低温度。可以将siRNA短期存储在4°C不超过一星期,但是应注意密封以避免蒸发。siRNA重悬浓度>1μM时可在–20°C保存一年。在开封前融化siRNA板并简单离心以使液体集中于板底。

RNA寡聚物易于被操作中引入的外源核酸酶降解。操作这些产品时请戴手套。使用RNase-free试剂,试管,以及带有过滤芯的移液枪头。收到文库后,您的siRNA可以长期存储在非自动除霜冰箱的–20°C或更低温度(寡聚物以干粉形式在室温运输)。

Ambion siRNA试剂以干粉形式在室温运输,在收到后应存储在非自动除霜冰箱的–20°C或更低温度。在这些条件下,siRNA至少可稳定存储3年。如果有必要,siRNA干粉(未开封)可以在4°C保存至少一年。

重悬Ambion siRNA板:

对每个板低速离心(最大速度 4,000 x g),以使所有内容物在开封前集中到板底。

使用70%乙醇或其它去除RNase污染的溶液如RNaseZap RNase Decontamination Solution(货号AM9780, AM9782, AM9784)擦拭密封膜表面。

1. 刺破或小心揭开封膜。小心不要撕碎封膜。

2. 加入无核酸酶的灭菌水,使用排枪或液体操作系统和无菌枪头,重悬至所需浓度。使用推荐体积的Ambion Nuclease-Free水(不是DEPC水)重悬siRNA至方便的存储浓度。建议重悬为10 μM或更高浓度。但是,2–5 μM的存储液浓度更适合用于高通量转染以及在自动化平台上进行的实验。

3. 小心吹打5次以重悬。将溶液在旋转混合器或摇床上室温混匀70–90分钟。这一额外混匀步骤确保充分重悬。

4. 如有必要,简单离心以使液体集中到板底。

5. (可选)将siRNA分装到一个或更多子板中,以减少冻融次数。

6. 存储于–20°C或更低温度。siRNA可以短期存储于4°C,但是应当注意密封以避免蒸发。

如需在重悬后重新密封,我们建议使用铝质而非塑料的封口膜。我们曾经使用过下列封膜,并取得了不错的效果:

  • Thermo Scientific™ Nunc™ Microplate Lids; Thermo Scientific货号250002
  • Sealing Films, Axygen Scientific,(货号47734-816),描述:铝封膜。在广泛温度条件下( –80°到97°C)保持微孔板的完美密封。适用于光敏感样本。均匀粘附。

转染

使用siRNA转染哺乳动物细胞的效率根据细胞类型和所用转染试剂的不同而不同。影响siRNA转染效率的主要因素如下:转染试剂类型和用量,每孔细胞数,siRNA类型,siRNA浓度。下表列出了Hela细胞的典型转染条件的不同变量。对于siRNA筛选试验,您所用的细胞类型的最佳转染条件应当通过预实验进行确定。因为Silencer Select siRNA表现出比其它siRNA文库更强的基因沉默能力,我们建议Silencer Select siRNA的使用浓度为常规siRNA类型所用浓度的5至10分之一。在对Hela和U2OS人骨肉瘤细胞进行脂质体转染时,我们发现Silencer Select siRNA在2–10 nM浓度下对目的mRNA的敲低效果可以达到80%以上。

对于Silencer Select siRNA,一个典型的转染实验设置如下:

试剂

Silencer Select siRNA板类型

 

96 孔板

384 孔板

Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂

0.1–0.5 µL

0.03–0.15 µL

细胞密度

6,000 细胞/孔

2,000 细胞/孔

每孔终体积

100 µL

50 µL

Silencer Select siRNA (终浓度5 nM)

0.5 pmol

0.125 pmol

 

对于Silencer siRNA (非修饰siRNA),一个典型的转染实验设置如下:

试剂

Silencer siRNA板类型

 

96-well

384-well

Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂

0.1–0.5 µL

0.03–0.15 µL

细胞密度

6,000 细胞/孔

2,000 细胞/孔

每孔终体积

100 µL

50 µL

Silencer Select siRNA (终浓度30 nM)

3 pmol

0.75 pmol

板规格和siRNA终浓度

0.1 nmol siRNA文库转染孔数

0.25 nmol siRNA文库转染孔数

1 nmol siRNA文库转染孔数

96孔,5 nM

200

500

2,000

96孔,30 nM

33

83

330

384孔, 5 nM

800

2,000

8,000

384孔, 40 nM

133

333

1,330

一次基因组范围的筛选需要用到800块96孔板。如果进行3次生物学意义的重复,那么总转染的孔数是:800块板 X 96孔 X 3个重复=230,400孔。

每孔需要加入0.15 µL的Lipofectamine RNAiMAX试剂 = 34,560 µL Lipofectamine RNAiMAX。即一次带有3复孔基因组范围筛选共需要~35 mL的Lipofectamine RNAiMAX试剂。

使用siRNA转染哺乳动物细胞的效率根据细胞类型和所用转染试剂的不同而不同。这意味着转染所用的最佳浓度需要根据经验确定。因为Silencer Select siRNA表现出比其它siRNA文库更强的基因沉默能力,我们建议Silencer Select siRNA的使用浓度为常规siRNA技术所用浓度的5至20分之一。在对Hela和U2OS人骨肉瘤细胞进行脂质体转染时,我们发现Silencer Select siRNA在2–10 nM浓度下对目的mRNA的敲低效果可以达到80%以上。

板类型

384 孔板

96 孔板

24 孔板

12 孔板

转染试剂a

0.03–0.15 µL

0.1–0.5 µL

0.75–3 µL

2–4 µL

寡聚核苷酸b

1.5 pmol

3 pmol

15 pmol

30 pmol

细胞密度

2,000 细胞/孔

6,000 细胞/孔

30,000 细胞/孔

60,000 细胞/孔

每孔终体积

50 µL

100 µL

500 µL

1.0 mL

a 建议使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂。根据转染试剂提供的说明使用推荐用量。

b此处的用量是按照寡聚核苷酸终浓度为30 nM计算的。

高效转染对于使用siRNA进行基因敲低实验是非常关键的;因此,最好在每个实验中包含一个阳性对照siRNA。阳性对照siRNA应该有明确的可重复性,并在研究所用的细胞和实验中具有易于检测的基因敲低效果和/或表型。如果使用阳性对照您观察到最大的基因敲低效果或超过/低于预设阈值的表型,那么您就能知道其它同时进行的siRNA实验是可靠的。需要注意的是要根据经验确定每个siRNA对照和检测方法的阈值以确定怎样才是好的转染效率。

在siRNA实验中,要想取得有意义的结果阴性对照和阳性对照同样重要。每次实验都要同时用至少一个无靶向作用的siRNA的阴性对照(如Silencer Select阴性对照#1)进行同摩尔量的转染——来自这些关键对照的数据将作为评估实验组靶基因敲低效果的基线。

未转染对照或仅有细胞的阴性对照对于siRNA实验也很有用。通过比较未转染的细胞和转染了非靶向阴性对照siRNA的细胞中某一持家基因的表达水平,可以获得转染对于细胞活力影响的关键数据。

最优的转染试剂取决于所用的细胞类型。尽管如此,我们发现Lipofectamine RNAiMAX转染试剂对于大部分细胞类型的siRNA实验均可提供高转染效率和低毒性。

板类型

转染体积(mL)

终浓度5 nM siRNA可能转染数(推荐用于Silencer Select siRNA转染易转染细胞系)

终浓度25 nM siRNA可能转染数(推荐用于Silencer Select siRNA转染易转染细胞系)

siRNA用量

0.1 nmol

0.25 nmol

1 nmol

5 nmol

0.1 nmol

0.25 nmol

1 nmol

5 nmol

6 孔

2.5

8

20

80

400

1.6

4

16

80

12 孔

1.0

20

50

200

1,000

4

10

40

200

25 孔

0.5

40

100

400

2,000

8

20

80

400

96 孔

0.1

200

500

2,000

10,000

40

100

400

2,000

我们对Silencer Select siRNAs (1, 30, 50, 及100 nM 终浓度)进行预先铺板并将其置于室温过夜。然后第二天在这些板内使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂转染HeLa细胞,对靶基因CSNK2A1仍然获得了大于80%的敲低效果。用户需要对于自己所用的细胞系进行优化,因为基因敲低的程度会不同。

很多研究者发现从他们最初的siRNA文库板获得他们想要重新测试或者进行后续研究的siRNA很不方便。我们的所有储存文库,以及很多定制文库,都将靶向同一靶基因的不同siRNA置于不同板的同一孔位。这使得选取针对某一靶点的siRNA进行后续实验非常容易。同时,Thermo Fisher Scientific可以方便的提供便宜的后续实验所需的siRNA,并可以板或者管的形式提供相同的siRNA或者靶向同一基因的其它siRNA用于后续实验。请联系我们询问关于价格和合成时间的信息。

不建议将siRNA混合使用。但是,用户可以根据自己实验的需求和限制设计自己实验。将siRNA混合使用的最大优点是这样可以减少脱靶效应。虽然这是第一代siRNA的主要问题,因为它们没有化学修饰并可以像miRNA一样靶向3‘ UTR,但是对于新一代的siRNA如Silencer Select siRNA,这已经不是问题。因为Silencer Select siRNA使用先进的生物信息学算法和规则进行设计并带有化学修饰,因此可以在低浓度下也可获得稳定和可靠的基因敲低效果并将脱靶效应降至最低。

高效和可重复的转染对于任何siRNA实验都是很关键的。siRNA实验的成败经常取决于siRNA的导入。优化siRNA的导入和转染过程中的细胞活力可以避免最常见的导致基因沉默实验失败的因素。最优的转染条件根据细胞系不同而不同。因此,在进行siRNA文库筛选前优化转染条件对于实现最高的基因沉默水平同时将转染过程的细胞毒性降到最低是必须的。

提前投入时间为您的实验体系找到最好的转染条件可以将siRNA摄入最大化、细胞毒性最小化,从而将转染的不稳定性降低并获得最好的数据质量。一旦您找出了最佳的转染方案,有趣和高产的文库筛选工作就可开始了

如果您已经找到了一种想用的转染试剂但是仍然想优化转染条件或在实验中监控转染效率,可以考虑使用Silencer Select阳性和阴性对照siRNA。

预定义文库

我们提供下列现成的人类Silencer Select siRNA文库:

  • 基因组
  • 扩展的药物靶点基因组
  • 药物靶点基因组激酶
  • 磷酸酶
  • G蛋白偶联受体(GPCR)
  • 离子通道
  • 核激素受体
  • 蛋白酶

我们还提供下列定制生产的预定义的Silencer Select siRNA文库:

  • 癌症基因组
  • 转录因子
  • DNA损伤反应
  • 凋亡反应
  • 表观遗传
  • 药物靶点
  • 药物转运体
  • 细胞周期调控
  • 膜转运体
  • 泛素连接
  • 细胞表面肿瘤抑制因子

对于Silencer siRNA文库,我们提供下列人和小鼠预定义套装:

  • 药物靶点基因组
  • 基因组
  • 激酶
  • 磷酸酶

我们还提供下列人类Silencer siRNA文库:

  • G蛋白偶联受体
  • 人蛋白酶,离子通道和核激素受体

Silencer Select 人类基因组siRNA文库V4中的siRNA靶向21,584个基因,每个目标基因有3个独立的非重叠的siRNA,总共64,752个siRNA。这些目标基因覆盖了98%的NCBI所列的对应至少一个RefSeq编码转录本的基因。这些siRNA被设计为可以靶向该基因所有当时已知的RefSeq编码转录本。该文库中那些靶向药物靶点的siRNAs根据基因功能分类排列以便对重要的基因亚群进行筛选。

Silencer Select 人类基因组siRNA文库V4(货号4397926)包含下列内容:

  • Silencer Select人类药物靶点基因组siRNA文库V4,384孔板(货号4397922)。该文库包含27,093个独特siRNA (0.25 nmol),靶向9,031个人类基因的转录本。共78块板:75块板每块352个siRNA,3块板每块232个siRNA。
  • Silencer Select人类药物靶点基因组siRNA扩展组V4,384孔板(货号4397924)。该文库包含4,149个独特siRNAs (0.25 nmol),靶向1,383个人类基因的转录本。共12块板:9块板每块352个siRNAs,3块板每块327个siRNAs。
  • Silencer Select人类基因组siRNA扩展组V4,384孔板(货号4397923)。该文库包含33,510个独特siRNAs (0.25 nmol),靶向11,170个人类基因的转录本。共96块板:93块板每块352个siRNA,3块板每块258个siRNA。

可以发邮件到rnailibraries@lifetech.com获取目标基因列表。

下面是对于Silencer Select文库的不同亚文库及它们如何组成更大文库的图片描述:

这些亚库通常都有库存并可以立即送货。请参看下列包装细节。

Silencer Select人类药物靶点基因组siRNA V4文库靶向9,032个基因,而Silencer Select人类扩展药物靶点基因组siRNAV4文库靶向这些基因以及其“扩展组”,总共10,415个基因,包括转录因子。

Silencer Select 人类基因组siRNA文库V4中2.8%的序列和Silencer人类基因组siRNA文库V3中相同。

Silencer Select siRNA文库及其亚库(Silencer Select人类药物靶点基因组,Silencer Select人类药物靶点基因组扩展组,以及Silencer Select人类基因组扩展组)被预装于384孔板内,每孔0.25 nmol siRNA。每块板的最后2列空白,并且靶向同一靶基因的siRNA位于不同板的同一孔位。

所有其它预制板Ambion siRNA文库都是每孔预装0.25 nmol siRNA于96孔板内。每块板最后1列空白,并且靶向同一靶基因的siRNAs位于不同板的同一孔位。

是的,文库的每块板都有一个唯一的条码。没有哪两块板具有相同条码编号,因此我们可以根据给定的条码对样本进行追踪。条码编号将一直列在随文库运送的电子数据文件中。

条码位于板的短边的第12列边上(中央)。该标签包括条码,一个人眼可识别的条码定义和一个板名称,以便于使用者对同一文库内的不同板进行排列。

板的命名旨在作为人可读的板编号,通常以字母和数字的组合结尾,可用于识别靶向相同靶基因的siRNA的板。我们的所有储存文库,以及很多定制文库,都有靶向同一靶基因的不同siRNA位于不同板的同一孔位。这可以被认为是―ABC‖格式,即某一板内的―A‖ siRNA与另一板内的―B‖ siRNA靶向相同靶基因并按同一顺序排列。

最简单的可能是举例说明。在Silencer人类磷酸酶siRNA文库V3中,有12块siRNA板:

Phos_V3_A1-1

Phos_V3_B1-1

Phos_V3_C1-1

Phos_V3_A1-2

Phos_V3_B1-2

Phos_V3_C1-2

Phos_V3_A1-3

Phos_V3_B1-3

Phos_V3_C1-3

Phos_V3_A1-4

Phos_V3_B1-4

Phos_V3_C1-4

如下所示,名称为‗A1-1‘的板内的siRNA(把它们作为 ―A siRNA)与‗B1-1‘板内的siRNA(把它们作为 ―B siRNA)和‗C1-1‘板内的siRNA(把它们作为 ―C siRNA)靶向相同靶基因并按相同顺序排列。与此类似, ‗A1-2‘板, ‗B1-2‘板和‗C1-2‘板内的siRNA也靶向相同靶基因。

如果您想进行一次混合siRNA的筛选,您可以将A1-1, B1-1,和C1-1板每块板的相同孔位合并。

需要注意的是板ID和板名称不同。每块板的ID是一个唯一的带―CPF的8位数编码。板ID印在条码上,为―3种9‖格式。板名称和板ID信息在随siRNA文库运送的文件中提供。

文件中包含一个带有下列栏目的Excel文件。文件的每行代表一个siRNA。

1. 批号:您的订单有一个唯一的批号。

2. 板ID:印在板上的唯一性条码。条码还以人可读形式印在板的标签上。

3. 样本ID:列于该行的siRNA的唯一批号。

4. 板名称:列于板标签上的可识别板名称。

5. 位置(行-列):该siRNA在板内的行和列位置。

6. 行:该siRNA在板内的行。

7. 列:该siRNA在板内的列。

8. RefSeq登录号:该siRNA靶标基因的RefSeq数据库编号

9. 基因标志:该RefSeq靶基因相应的NCBI Entrez基因标志

10. 基因全名:该RefSeq靶基因相应的NCBI Entrez基因名称

11. 基因ID:该RefSeq靶基因相应的NCBI Entrez基因ID

12. siRNA ID:代表该siRNA序列的唯一编号。我们使用产品编号(或称货号)指定该siRNA序列的合成量、纯化方式以及siRNA ID。要重新订购某个siRNA,您需要提供产品货号和siRNA ID。

13. siRNA量:每孔的siRNA量,以nmol表示。

14. 目标外显子:该siRNA靶向的外显子。

15. 正义siRNA序列:以 5‘至3’排列的siRNA正义链(传递链)序列。

16. 反义siRNA系列:以5‘至3’排列的siRNA反义链(引导链)序列。

17. 经验证与否:A——是‖表明我们已经使用qRT-PCR验证过该特定siRNA序列并且它通过了我们的基因敲低标准(使用5 nM Silencer Select siRNA时mRNA敲低效果达到80%或更多)。

18. 平均剩余RNA水平:在验证实验中平均的剩余mRNA百分比(如果有数据的话)

19. 正向误差线:平均剩余RNA水平的正向误差线(如果有数据的话)

20. 负向误差线:平均剩余RNA水平的负向误差线(如果有数据的话)

21. 细胞系:验证siRNA所用的细胞系(如果有数据的话)。

我们只需在持续更新注释信息的数据库中运行您的siRNA文库文件,就可提供更新的注释信息。要获得之前购买的siRNA文库更新的注释信息,请联系赛默飞世尔技术支持部门,可发邮件至rnailibraries@lifetech.com并提供您的siRNA数据库的批号。

Silencer Select人类基因组文库可以384孔板或96孔板形式购买。两种形式分别包含186块384孔板或738块96孔板。每块384孔板的最后两列为空白,而每块96孔板的最后一列为空白。

是的。请注意这些盖子没有被标记,所以不需要保持盖子和板配套。

我们使用一个热封系统将封膜附在Ambion siRNA文库板上。为避免胶水粘在板上,您可能需要在板子仍冷冻时(–20°C或–80°C)打开封膜。

以下是一些使用了Ambion siRNA文库/套装的参考文献。这只是一部分。请联系我们获取最新参考文献名录,请发邮件到rnailibraries@lifetech.com.

Silencer Select siRNA

  • Phenotypic profiling of the human genome reveals gene products involved in plasma membrane targeting of Src kinases. Ritzerfeld J, Remmele S, Wang T et al. (2011) Genome Res Jul 27 (available online)
  • Identification of protein kinases that control ovarian hormone release by selective siRNAs. Sirotkin AV, Ovcharenko D, Mlyncek M (2010) J Mol Endocrinol 44:45–53.
  • Selection of hyperfunctional siRNAs with improved potency and specificity. Wang X, Xiaohui Wang X, Varma RK et al. (2009) Nucleic Acids Res:37: e152.
  • Protein kinases controlling PCNA and p53 expression in human ovarian cells. Alexander V Sirotkin AV, Ovcharenko D, Benco A et al. (2009) Funct Integr Genomics 9:185–195.

 

Silencer siRNA

  • Identification of host factors involved in borna disease virus cell entry through a small interfering RNA functional genetic screen. Clemente R, Sisman E, Aza-Blanc P et al. (2010) J Virol 84:3562–3575.
  • siRNA screening reveals JNK2 as an evolutionary conserved regulator of triglyceride homeostasis. Grimard V, Massier J, Richter D et al. (2008) J Lipid Res 49:2427–2440.
  • Polo-like kinase 2 (PLK2) phosphorylates alpha-synuclein at serine 129 in central nervous system. (2009) Inglis KJ, Chereau D, Brigham EF et al. J Biol Chem 284:2598–2602.
  • Identification of survival genes in human glioblastoma cells by small interfering RNA screening. Thaker NG, Zhang F, McDonald PR et al. (2009) Mol Pharmacol 76:1246–1255.
  • Low-dose arsenic trioxide sensitizes glucocorticoid-resistant acute lymphoblastic leukemia cells to dexamethasone via an Akt-dependent pathway. Bornhauser BC, Bonapace L, Lindholm D et al. (2007) Blood 110:2084–2091.
  • Visual screening and analysis for kinase-regulated membrane trafficking pathways that are involved in extensive β-amyloid secretion. Adachi A, Kano F, Saido TC et al. (2009) Genes Cells 14:355–369.
  • Identification and characterization of 3-iodothyronamine intracellular transport. Ianculescu AG, Giacomini KM, Scanlan TS (2009) Endocrinology 150:1991–1999.
  • High-throughput RNAi screening in vitro: from cell lines to primary cells. Ovcharenko D, Jarvis R, Hunicke-Smith S et al. (2005) RNA 11:985–993.

定制设计的siRNA文库

请联系您的当地销售代表或发邮件到rnailibraries@lifetech.com联系我们。我们将为您提供询价表,精确获知您希望如何构建自己的siRNA文库。您将需要准备提供如下信息:

  • 您的基因/靶点列表(最好是NCBI Entrez基因ID;RefSeq mRNA登录号也可)
  • 您选择Silencer Select siRNA,Silencer siRNA (非修饰),还是Ambion In Vivo siRNA
  • 每个靶点所需的siRNA数目(通常每个编码基因对应3个siRNA)
  • 每孔所需的siRNA量:
  • Silencer Select siRNA有0.1、0.25、1、2或5 nmol规格
  • Silencer siRNA有1、2或5 nmol规格
  • 您想要的预制板类型

SilencerSilencer Select siRNA人类基因组siRNA文库套装包括靶向NCBI Entrez基因数据库内所列大部分基因的siRNA,每个基因3个siRNA。这些siRNA通常有库存,因此,这些siRNA的成本和价格比我们专门为您定制的siRNA便宜。要提供询价,我们必须比较您的基因列表和我们库存的siRNA列表。

您的基因列表和定制siRNA信息将严格保密,不会用于除询价或合成您的定制siRNA文库之外的任何目的。

对于定制siRNA文库,我们可以提供多种制板选择,我们遇到最多的要求是将每块96孔板的最后1列或2列留为空白,并将靶向同一靶点的不同siRNA置于不同板的同一孔位。空白列便于在最终的转染板内加入任何想要的对照。当靶向同一靶点的不同siRNA被置于不同板的同一孔位时,可以方便使用机械臂或排枪将siRNA混合使用。另外,这种形式有利于qRT-PCR分析。

出货时间依据siRNA数量和制板要求的复杂程度而不同。大部分Ambion siRNA文库订单在订单处理后1-3周内完成。您的特定文库的预计出货时间将和您的报价单一起提供给您。请联系您当地的销售代表或发邮件到rnailibraries@lifetech.com获取更多信息或询价。

通常认为每个靶基因至少需要两个有效的siRNA证明某个表型是由目的基因敲低引起而不是因为脱靶效应。由于Silencer Select siRNA设计的算法以及创新的化学修饰降低了脱靶效应而不影响siRNA的性能,Silencer Select siRNA与其它siRNA技术相比能更有效诱导产生特异表型的百分比显著提高。

 

上图显示:Silencer Select siRNA引起的预期表型比例高于其它siRNA。靶向7个RNAi诱导表型明确的目的基因的siRNA被分别以3 nM转染进入细胞,并在 48小时后测定表型。每个柱形代表siRNA给出预期沉默表型的百分比。靶向BUB1B, AURKB, WEE1PLK1的siRNA效果在U2OS人骨肉瘤细胞内使用多参数细胞生长/凋亡实验进行评估。靶向HMGCR, LDLRFDFT1siRNA效果在HUH7人肝癌细胞中使用LDL吸收实验评估。

因此在筛选中您需要更少的siRNA就可以获得确定的结果,从而自信地用阳性筛选结果进行后续实验。使用3个高效siRNA而不是4个低效siRNA,可以将您的筛选成本降低三分之一。

如果您仍然想要在文库中有4个siRNA靶向同一靶基因,可以选择从我们的人类Silencer文库中加入一个siRNA。

miRNA文库

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我们提供三种mirVana™ miRNA文库,适用于:人,小鼠和大鼠。所有三种文库均覆盖所有miRBase v.20中的microRNA。您可点击此处询价。