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系统与试剂盒组件

这里列举了一些Neon转染系统的特性:

  1. 2.Neon转染系统使用了一款通用型的转染试剂盒(Neon试剂盒),能够兼容包括原代细胞和干细胞在内的多种哺乳动物细胞类型,进而能够帮助用户免除分别为每一类细胞优化缓冲体系的麻烦。本品提供了两种细胞重悬缓冲液,能够覆盖各类细胞应用。T缓冲液适用于原代T细胞与B细胞、PBMC、单核细胞与骨髓来源细胞,而R缓冲液适用于已建系的贴壁细胞和悬浮细胞,以及原代贴壁细胞。
  2. 4.Neon转染系统能够广泛兼容不同数量的细胞样本。如果使用100 μL转染体系,最多可转染5 × 106 个细胞;如果使用10 μL转染体系,最少可转染1× 104个细胞。
  3. 6.我们为用户提供开放透明的实验方案,这些优化后的方案简单易用。Neon细胞数据库包含了多种常用细胞类型优化好的转染方案。
  4. 8.Neon设备预先编程了一个24孔的优化方案,能够针对您的核酸/siRNA和特定细胞类型提供最佳优化条件。

Neon转染系统所提供的是Digital Bio/NanoEntek Microporator(MP-100)的第二代转染系统。这两款设备的独特属性是均使用了移液枪头做为转染容器,来替代标准的电转杯。这些设备具有相同的使用性能,但也有一些区别。两者主要的不同点在于用户界面。Neon转染系统拥有升级的固件,能够比Digital Bio Microporator MP-100上传更多的程序。MP-100 Microporator为白色,显示屏幕比Neon转染系统略小。Neon转染移液工作站(Transfection Pipette Station)不兼容MP-100移液器(白色)。这是由于MP-100传感器连接器(2针连接)不同于Neon移液工作站所致(12针连接)。我们未提供兼容适配接头。这两款系统中的试剂盒与组件完全一致,只是在Neon转染系统中打上了Neon的标识。旧版本的手册也适用于Neon转染系统设备。关于Neon转染系统历史的更多详情请参见此页面.

请点击此处了解更多关于Neon转染系统与Amaxa Nucleofector II系统之间的比较信息。

不同于标准的电转杯容器,Neon系统使用了专利的生物相容性移液枪头作为电转容器。移液枪头中内置金包被电极丝的设计能够为细胞悬液提供更为均匀的电场和更低的pH梯度。因此,这一设计能够更好地维持生理条件,从而达到比传统电转法更高的细胞存活率(Kim JA, Cho K, Shin MS, et al.(2008)A novel electroporation method using a capillary and wire-type electrode.Biosens Bioelectron 23(9):1353–1360)。

Neon转染系统能够向所有类型的哺乳动物细胞中高效导入核酸(DNA/siRNA)。相比之下,脂质转染试剂向原代细胞、干细胞和造血细胞等难转染细胞导入核酸的效率较低。病毒导入例如以慢病毒和腺病毒为媒介,能够向难转染细胞高效导入DNA和siRNA(基于我们提供的shRNA或miRNA载体),但生产病毒非常耗时,也是一个更为复杂的工艺流程。

重悬缓冲液(缓冲液R或T)适用于在电转前重悬细胞,而电解缓冲液(缓冲液E或E2)适用于电转过程,需要在电转前加入Neon管中。

R型与T型重悬缓冲液均适用于在电转操作前对细胞进行重悬操作。R型重悬缓冲液为标准的细胞重悬缓冲液,可用于重悬已建系的贴壁细胞,悬浮细胞,以及原代贴壁细胞。T型重悬缓冲液为细胞重悬缓冲液的一个备选,可用于重悬原代T细胞与B细胞、PBMC、单核细胞和骨髓来源细胞。其组成成份不同于R型缓冲液,由于其导电性较低,从而可应用更高电压。本品不适用于建立好的细胞系或已经培养了一段时间的原代细胞。如果用户无法即刻明确这两种缓冲系统哪种更适合自己的细胞,我们推荐您分别进行独立优化实验,以测试其实际使用效果。

对于血液来源的原代悬浮细胞,如原代T细胞与B细胞,PBMC,单核细胞和骨髓来源细胞,我们推荐使用T缓冲液代替标准的R缓冲液。这些细胞比常见细胞系的体积更小,因此需要更高的电压来达到成功的电转效果。如果您使用R缓冲液并施加高电压(超过1800V),无论使用怎样的细胞数量和转染条件,您都会观察到电火花或电弧。R缓冲液可施加的最高电压为1900V左右。T缓冲液的成份区别于R缓冲液,具有更低的导电性,因此T缓冲液可胜任更高的电压条件。

我们不提供重悬缓冲液R的单品。我们的试剂盒为Neon™枪头准备了2倍以上的缓冲试剂。

E2型缓冲液比E型缓冲液拥有更高的渗透压。这一更高的渗透压能够避免电转体系从100 μL Neon™枪头中漏出,100 μL的 Neon™枪头比10 μL Neon™枪头的末端孔径更大(Neon™枪头的孔直径:100 μL 枪头为2.10 mm;10 μL枪头为0.65 mm)。

所有这些缓冲液的成份都是保密的。

Neon™设备使用了方波脉冲;脉冲宽度为1-100ms,脉冲数量范围在1-10次。电压范围在500-2500 V之间。

脉冲间隔固定在1ms。

是的,Neon™枪头可匹配Digital Bio/NanoEntech的移液器。

Neon™试剂盒的保质期为从购买日起一年时间。

不可以。Neon™试剂盒只能成套购买,每个套装能够完成50或192次反应。Neon™转染管可单独购买(目录编号 MPT100)。Neon™试剂盒为每个枪头提供了足够完成两次电转的缓冲液。

Neon™枪头已由生产商永久校准,用户无需进一步调校。

我们推荐您使用潮湿的抹布来清洁Neon™设备与Neon™移液工作站的表面。不要使用强去垢剂或有机溶剂清洁设备组件。避免任何液体溢出到Neon™移液工作站中。如果您不小心将任何液体(如缓冲液、水、咖啡)溢出至Neon™移液工作站内部,请立即从主设备上断开工作站的连接,再用干燥的实验室用纸擦干工作站。倒置工作站并在室温下放置24小时,以使其完全干燥。不要使用烘箱干燥Neon™移液工作站。

用法

在我们的Neon™细胞数据库中,我们为每一种细胞类型提供了完整的电转优化参数和通用型电解缓冲液。由于您使用细胞的传代次数和/或培养条件,或分离步骤不会与我们所用的完全一致,因此您可基于特定细胞系对这些实验条件进行微调。数据库中的实验条件可作为您自身优化工作的起点。对于我们数据库中未列举的细胞系,Neon™设备中内置了预先编程的优化实验方案。

有的。您可在此在访问Neon™引用列表。

我们的对照质粒是基于pCDNA 6.2载体,以CMV启动子启动EmGFP表达的质粒,大小为5.9 kb。我们的纯化步骤是保密的,不过质粒纯度相当于两轮的阴离子交换层析操作。此质粒不可传播使用,我们也不提供任何可筛选标志物信息。

使用Neon™系统进行电转的过程中,某些有聚集趋势的细胞(如PC-12细胞)可能“偶尔”出现细胞融合的副效应,不过很可惜,我们并未专门提供Neon™程序来优化细胞融合条件。

目前,我们尚未提供细菌电转的Neon™实验方案。不过,Neon™转染系统可用于电转衣藻。请参见GeneArt衣藻基因工程试剂盒手册第13页和 GeneArt衣藻TOPO基因工程试剂盒手册第18页中推荐的电转方案。

我们目前尚未为此操作提供经过验证的方案。不过,我们可基于最近发表的文献(Alvarez-Erviti et al., Nature Biotech 29(4):341–347, 2011),向您推荐一些用于尝试的初始参数。文献中使用的是未注明品牌的基于电转杯的电转仪器,文中所用参数为400V和127 mF。对于Neon™系统,对应的参数在1350V左右。我们推荐您以此电压运行优化的实验方案;不过,我们很难向您推荐脉冲宽度或脉冲数——因此,还是有必要优化实验条件的。

我们推荐您使用阴离子交换层析法来制备转染级的质粒DNA。我们的PureLink HiPure质粒纯化试剂盒系列产品即使用了这一技术。对于大质粒的抽提(>50 kb),请勿使用含有过滤器或沉淀器的PureLink HiPure纯化试剂盒,以避免质粒受损。我们不推荐使用离心柱来纯化质粒,因为它们所含的硅胶膜去除杂质的能力无法达到阴离子交换树脂同一水平。

我们没有内部实验数据,不过来自客户的一些报告提示本系统能够在多种细胞系上完成这一操作。

不含特殊重组序列的环状与线性化质粒的转染能力相同,也按照相近的概率整合进入基因组。不过,质粒上的重组位点会受线性化处理的影响,自由末端的整合效率会高于中间连续序列。在大多数情况下,您可通过质粒线性化决定质粒上重组发生的位置,从而保护表达组件。

通常情况下,电转染是一种质粒大小依赖的转染技术,转染效率将随质粒大小的增加而降低。我们在内部实验室中通常使用4-7 kb的质粒,而转染20 kb以内长度的质粒应该都不会有问题。使用超过这一长度的质粒将很可能导致转染效率变低。初步研究结果提示细菌人工染色体(BAC)也能够通过本系统进行转染,只是转染效率较低。请记住,1 mg 6kb长度的质粒在体积摩尔浓度上等同于2 mg 12kb的质粒。在比较不同长度质粒的转染效率时,需要将此因素考虑进来。举例来说,如果需要将1mg 10kb质粒与150kb BAC的转染效率做比较的话,就需要使用15 mg的BAC。但这是不可行的,因为如此大量的DNA对细胞是有毒的。另一方面,这并不意味着Neon™无法转染BAC。只是DNA使用量太大时转染效率会很低。

某些大质粒上所观察到的毒性效应与其长度并不相关,而更可能是由质粒所含序列,质粒制备过程引入的LPS一类污染物,电转极大量的质粒等因素所致。请保持使用基于阴离子交换层析的试剂盒(如我们的PureLink HiPure试剂盒)来制备转染级的质粒DNA,同时避免柱体超载——否则可能会产生低纯度的质粒。

强电场的应用会削弱细胞膜结构,导致膜孔的形成,抗生素也会由此进入细胞内部。后续产生的毒性代谢中间产物很可能介导细胞死亡的发生。此外,链霉素会与真核细胞核糖体相结合,进而直接干扰蛋白翻译过程。如果您的细胞需要培养于含抗生素的条件下,您可在电转操作数小时之后再加入抗生素。

  • 如果您在Neon™细胞数据库中找到一种与您所用细胞具有相同组织来源的类似细胞株时,您可借用这一细胞的参数。这并不保证您能够获得最佳结果,不过是一个好的尝试起点。举例来说,如果您拥有293T细胞,而又在Neon™细胞数据库中找到了HEK293细胞的转染方案,您就可将HEK293细胞的电转参数用于293T细胞,因为两者都源自人胚肾。
  • 您可在Neon™设备中使用预先编程好的24孔优化方案来优化您的细胞转染条件。
  • 请联系技术支持 来进一步商讨。

这些设置是基于我们对大量细胞系和原代细胞的内部经验来进行挑选的。如果所有这些参数设置都无法成功帮助您将质粒DNA转染进细胞,那么其他条件也未见得能成功。不过,如果使用某些设置获得的转染效率较低,您可对电压、脉冲宽度和脉冲次数等参数进行精细调节来优化条件,则转染效率很可能得到进一步提升。

我们目前尚未提供此类服务。Neon™转染系统专为提升转染条件的优化效果而设计。通常情况下,三轮优化就足以为任意种类的细胞系或原代细胞取得最佳的仪器设置参数。除非您以极少量组织或难于处理的组织制备细胞,否则条件优化工作的时长不会超过一周,并且在花费上远远低于定制服务。

Neon™转染管是一次性用品,我们推荐您最多使用每管转染10次(相同的质粒/siRNA/细胞类型),以最大限度地减少交叉污染的可能性。此外,我们强烈推荐您使用一个全新的Neon™管来转染不同类型的DNA/siRNA或细胞,以避免交叉污染。如果您需要为实验匹配额外的Neon™管,可单独进行购买(目录编号 MPT100)。

我们强烈建议不要洗涤Neon™枪头。洗涤无法去除枪头上面粘附的DNA或siRNA,还会增加样本间交叉污染的风险。另外,枪头也无法消毒,也很容易增加培养物被微生物污染的风险。

为了避免样本间的残留污染,我们不推荐您重复利用Neon™枪头。不过如果您需要执行24孔优化操作或重复操作两组转染实验,这时的枪头可使用两次。我们之所以这样推荐的原因是枪头中的电极表面镀有24k金,每次施加电脉冲时都会释放掉一些金离子。因此,重复使用枪头会使金包被层变薄,从而导致枪头的导电性发生改变。我们发现在使用三次后的枪头上这种变化即可测量到。如果您希望向细胞施加绝对准确的电压和电流,每个枪头您只能使用两次。

如果您使用同种质粒/siRNA和同种细胞,电解缓冲液最多可使用10次,之后需一并更换反应管和缓冲液。如果您使用不同的质粒/siRNA或细胞类型,我们推荐您使用两次即更换缓冲液,以避免残留污染。

可以。Neon™转染系统适用于任何RNAi介质(siRNA,shRNA,miRNA)。您可应用与DNA相同的细胞特异型实验方案,或利用预先编程的24孔板优化条件进行实验方案优化

Neon™转染所用siRNA浓度指的是培养基中浓度,而非Neon™枪头中电转体系的siRNA浓度。举例来说,如果使用100 μL Neon™枪头对培养在24孔板,500 μL培养基中的细胞进行转染操作,则siRNA浓度需按照500 μL培养基进行测量,而非按照100 μL电转体系的体积进行测量。

一个比较好的尝试起点是同种细胞类型的质粒电转参数。Neon™细胞数据库为多种常用类型的细胞准备了优化的质粒转染方案。如果Neon™细胞数据库未包含目的细胞类型,您可使用Neon™设备中预先载入的24孔优化实验方案。如果您需要进一步的帮助,请联系技术支持

在大多数情况下,针对某一细胞系或原代细胞的质粒转染而进行优化的仪器设置也适用于siRNA。不过,这些设置参数并不一定是递送siRNA的最佳参数。因此,如需提升靶标的敲低效率,可能仍需要额外的优化操作。对于未经质粒DNA转染条件优化的细胞系或原代细胞,一组24孔优化实验可能是找到优化条件的最佳手段。请记得在每个测试条件中加入一个siRNA阴性转染对照,以便对敲低效率进行标准化计算。

Neon™细胞数据库包含多种常用细胞类型的优化转染方案。由于您所用细胞系的传代次数和/或培养条件,或分离步骤不会与我们所用的完全一致,因此您可基于特定细胞系对这些实验条件进行微调。数据库中的实验条件可作为您自身优化工作的起点。对于我们数据库中未列举的细胞系,Neon™设备中内置了预先编程的优化实验方案。

我们当前没有支持此项操作的数据,不过共转不同种质粒的操作是可行的。不过,DNA的用量需仔细斟酌,如果细胞中质粒DNA过载,或使用不恰当的质粒比例可能会导致细胞毒性的出现。因此,我们推荐您以低量DNA开始尝试共转实验的优化,并逐步增加DNA用量。如果观察到细胞毒性,则需尝试多种不同的质粒比例。

是的,我们的内部数据表明,共转染EmGFP表达质粒和特定的siRNA时可观察到EmGFP的敲低效果,内源基因上也获得了类似的敲低效果。

在内部,我们使用10 μL枪头最低转染30000个细胞。如果电转的细胞密度过低,存活率通常就会有所下降。这一效应也是细胞类型依赖的。因此,不影响您细胞系或原代细胞存活率的最低细胞浓度需要根据经验来确定。我们的一位客户已经报道成功转染了5000个原代毛囊细胞。

按照Neon™指南中的说明,您可在100 μL的系统中转染最多8百万个细胞。如果细胞体积足够小,则100 μL的系统中转染最多1千万个细胞。

电转完成后,请等待4-6小时再向细胞中加入抗生素。请确保细胞膜的完整性彻底恢复。

由于电穿孔术是通过电击来在细胞膜上打孔的,这一过程会对某些膜蛋白造成损伤。但随着时间推移,这些膜蛋白将会逐渐复原。复原时间依赖细胞和蛋白类型的不同而存在差异。目前对此问题尚未形成通用性的指南。在电转后不会进一步增殖的原代细胞中,这一膜损伤可能是永久性的,某些膜蛋白的功能也会受到干扰。  

没有理由去怀疑10 μL与100 μL Neon™枪头之间优化的电转参数存在差异。因此,即使Neon™细胞数据库指定使用10 μL枪头,这些条件对于100 μL枪头也是适用的,推荐的细胞密度也同样适用。如果发现转染效率降低,则用户可能需要对电压设定值进行微调来提升转染效率。通常情况下,没有必要使用100 μL枪头进行24孔优化。

最佳的蛋白分析时间点与所表达蛋白的稳定性有关。蛋白产物的半衰期可能短至数分钟,长至数天。对于半衰期短的蛋白(如荧光素酶),电转6-18小时后即可进行蛋白分析。对于GFP等更为稳定的蛋白,电转后24小时乃至稍晚一些均可进行分析。

各类mRNA及其蛋白产物的稳定性和半衰期之间差异很大,所以根据经验来确定靶标敲低效果的最佳评估时间点至关重要。举例来说,据报道在哺乳动物细胞中,mRNA的半衰期在数分钟至数天的范围(Ross J, 1995, Microbiol Rev 59:423–450),而蛋白产物的半衰期短至数分钟,长至数天。通常情况下,敲低靶标mRNA的推荐时程在12-72小时,充分敲低靶标蛋白的时程在24-96小时。我们推荐用户在电转后8,24,48,72和96小时的时间点通过qPCR技术检测mRNA敲低效果,以确定最大敲低效率的时间点。同样地,用户也可通过ELISA(更精确)或免疫印迹(精确性稍低)技术进行时程分析以确定蛋白敲低效率。

细胞存活率是指总细胞群体中确定具有活力的细胞数目。转染效率是指在所有存活细胞中成功表达您所构建载体的细胞数目(即,GFP阳性细胞)。

细胞活力也可通过碘化丙啶染色或台盼蓝拒染法来进行测定。对于贴壁细胞,可在染色前使用胰酶或TrypLETM Express试剂进行细胞消化处理。用户可通过荧光显微镜选择适于检测GFP(发射波长:509 nm)的滤镜组来测定转染效率。可通过FACS或Countess自动细胞计数仪来进行细胞计数。

如需测定siRNA的Neon™转染效率,我们推荐使用荧光标记的阴性对照siRNA来转染细胞(BLOCK-iTTM荧光寡聚物,目录编号13750062),并通过活细胞中荧光标记细胞的百分比来确定转染效率。不过,使用此方法时请牢记:通过荧光标记的阴性对照siRNA所确定的转染效率有高估的可能,这是因为通过显微镜进行的荧光检测无法区分进入胞内的siRNA和粘附在胞膜上的siRNA。如希望更为准确地测定转染效率,则需使用阳性对照siRNA(如靶向看家基因的siRNA)转染细胞,再检测靶向RNA或蛋白的敲低效果。

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