查找重要信息。

我们总结了一系列要点提示和技巧并建立了一个详细的知识库,以满足您的各类科研需求,助您优化试验,获得最理想的结果。

请浏览下列相关问题:

实验遇到问题了吗?欢迎访问我们的

问题排查页面

更多信息请浏览我们常见问题解答数据库 ›

概述

目前有很多种基因递送技术,可向真核细胞中导入质粒DNA、siRNA或双链RNAi、寡核苷酸和RNA,以便进行各种研究和药物开发应用。此处提供了有关这些技术及其优缺点的综述。

请参阅转染试剂选择指南进行正确的选择。

我们的转染试剂是在常温条件下运输的,在收到产品后应立即置于4℃条件下储存。如果贮存和使用得当,除了管子标签或者产品COA文件中有特别标注外,我们保证从收到产品之日起一年内产品的性能正常。我们不推荐冻存转染试剂,因为冻存一般会降低转染效果。

Please see this paper on ambient shipping of Lipofectamine transfection reagents.

是的,细胞密度会影响转染性能。 Lipofectamine 3000, Lipofectamine 2000Lipofectamine LTX/PLUS能够在70-90%的细胞汇合度时展现优异的转染性能,而汇合度低于这一数值时,则可能观察到细胞毒性。Lipofectamine RNAiMAX在60-80%的细胞汇合度时效果最佳。

传代次数可能会影响转染实验。我们推荐一致地传代和接种细胞。传代次数过多可能会降低转染效率。我们不推荐超过20-30次传代的细胞。如果转染性能下降并且细胞已经培养过很长时间或过度/不当传代,我们建议您从液氮中复苏一瓶新细胞重新培养。请参阅 Gibco细胞培养基础手册,了解正确培养和传代细胞的指南。

不可以,转染效率和每个孔所用试剂的量密切相关,并可能因试剂而异。为了获得最佳转染效率,请参考随转染试剂提供的产品信息。

随产品提供的实验方案将为您提供每个孔转染试剂的最佳使用量范围。在产品开发期间,该使用量在多种细胞系中都能很好地工作。如果在您特定的细胞系中没有得到预期的效果,可能还需要做进一步的优化。

我们的每个转染试剂实验方案均提供了一个表格,用于放大或缩小转染体系。详细信息请参考具体的说明书。

一般情况下,无论如何尝试控制转染影响因素,两次转染的效率仍会表现出一定程度的差异性。转染时,请保持所有转染影响因素,如细胞汇合度、传代次数和生长期一致。尽可能解冻新的细胞。为了尽量减少转染差异的影响,可以使用内参,如β半乳糖苷酶或萤光素酶。可以共转染表达质粒和参考质粒,分析β-gal或荧光素酶的活性。

瞬时转染克隆的表达水平通常比较高,因为瞬时转染细胞通常具有较高的外源基因拷贝数(每个细胞几百个)。稳定转染的克隆通常有1-2个拷贝整合进基因组,因此其表达水平较低。有时候,稳定转染细胞的表达水平低是因为当组成型表达重组蛋白时对细胞造成了负面影响。

特定细胞系的转染方案可点击此处找到。如果您未找到特定细胞系转染方案或者方案没有达到预期效果,我们建议测试随产品提供的实验方案中描述的条件,确定最佳的实验方案。 成功的转染依赖于细胞类型、脂质体用量、细胞的健康情况、传代次数和转染时的细胞密度。这些因素在各个实验室之间可能略有不同,为了得到相同的结果,可能需要对实验方案进行额外的优化。

访问每种类型试剂的产品页面,在页面底部即可看到有一个引用列表。您也可访问一个罗列特定细胞系参考文献的表格。我们还建议采用www.highwire.org作为搜索引擎来查找使用我们转染产品的最新研究论文。您只需在搜索条件中直接列出转染试剂的名称和您的细胞系/应用。

脂质体转染过程中不是必须需使用无血清培养基。然而,在无血清条件下形成脂质体:核酸复合体是至关重要的,因为蛋白质可能会干扰复合体的形成。一旦复合体形成,即可将其加入到含血清培养基的细胞中。

可以,转染过程中可以在培养基中使用抗生素。我们比较了多种细胞系,细胞在有和没有抗生素的培养基中的转染效果,经过评估二者转染效率和细胞毒性,并发现没有差异。对于稳定转染,,需在转染至少72小时后,再添加选择性抗生素。

是的,在存在致死剂量的G418的情况下,细胞最多可以继续分裂两次。药效通常会在两天后显现。

可以。标准转染实验方案需要保持转染混合物中DNA的总量恒定。也就是说,如果您的试验方案需要1 mg的质粒,则两种共转染质粒各使用0.5 mg,或是4种共转染质粒各使用0.25 mg。当利用共转染对不同的质粒引入选择性标记时,我们建议使用摩尔比3:1至10:1,目标质粒比选择质粒过量,以确保目标质粒和选择质粒同时存在。

我们的阳离子脂质体转染试剂可用于转染DNA、siRNA、Stealth™ RNAi、mRNA、dicer-产生的siRNA混合物、或shRNA质粒。寡核苷酸,蛋白质和RNA也可由其转染。DNA可以是质粒、粘粒,甚至是长达600 kb的YAC克隆。

您可以使用i) Lipofectamine 3000和P3000一起 或是 ii)Lipofectamine 2000共转染质粒和siRNA。

对于大多数类型的细胞,我们建议使用Lipofectamine RNAiMAX来进行Silencer Select、Silencer、Stealth™ RNAi和标准siRNAs以及Dicer-产生的siRNAs的瞬时递送。含有shRNA或miRNA表达框的质粒DNA可以使用Lipofectamine 3000、Lipofectamine 2000或Lipofectamine LTX进行转染。

我们提供多种PureLink™HiPure纯化试剂盒来制备无内毒素DNA,PureLink™HiPure纯化试剂盒有Mini、Midi、Maxi、Mega和Giga几种规格。这些试剂盒包含一种采用阴离子交换树脂纯化质粒DNA的专利技术,该技术的纯化水平是氯化铯梯度纯化技术的两倍。想了解更多信息,请点击 此处。 

1 A260单位(质粒DNA溶于H2O)=50mg/mL。如果质粒DNA使用除H2O之外其他缓冲液稀释,则消光系数会改变。这会导致上述值发生变化。

计算举例:

质粒DNA样品的体积= 100mL

稀释(1/20)= 25mL样品加入475mLH2O中

稀释样品的A260= 0.65

注:为了达到最佳效果,确保OD值在0.1和1.0之间。

质粒DNA样品的浓度=0.65×50mg/mL×20(稀释因子)=650mg/mL

样品的质粒DNA量=650mg/mL×0.1mL(样本量)= 65mg

A260 / A280值大于或等于1.8,意味着该质粒DNA是纯的;A260 / A280读数小于1.8,表明样品可能被芳香族产物(即苯酚)或蛋白质污染;读数大于2.0,则表明样品被RNA污染。

这些产品都是不同的阳离子脂质体试剂。Lipofectamine3000为质粒DNA和RNAi转入最广泛类型的细胞提供了最佳的转染性能。LipofectamineLTX用于以最小的细胞毒性递送质粒DNA。虽然PLUS™试剂可以单独购买(货号11514-015),但LipofectaminePLUS转染试剂目前已经停产。Lipofectamine最初于20世纪80年代末发布,被认为是我们的第一代转染试剂。我们将继续为偏向使用老试剂的客户提供这些产品,但建议所有的新客户开始尝试Lipofectamine3000以获得最佳的转染性能和最低的细胞毒性。

对于瞬时转染,转染的DNA没有整合到宿主基因组中,所以外源DNA在后续的细胞有丝分裂阶段将丢失。外源基因的表达是短暂的(最长7-10天),但表达水平很高,因为在同一个细胞里会有多个拷贝的DNA。对于稳定转染,转染的DNA能够整合到宿主基因组,因此转染细胞及其子代细胞的基因组中会同时保留转染的DNA。外源基因也会随着筛选过程而表达。由于每个细胞中只整合了1-2个DNA拷贝,所以表达水平较低。稳定转染的转染效率只有瞬时转染的1-10%。

脂质体介导的转染的主要优势是能取得更高的转染效率,即使是不能使用磷酸钙介导转染的细胞类型。此外,脂质体介导的转染不仅能用于寡聚核苷酸到大DNA范围内的DNA递送,还能递送RNA和蛋白质。

转染无法用于某些细胞类型,例如非分裂细胞,而病毒转导既能用于分裂细胞又能用于非分裂细胞,比如难以转染的神经细胞。

剂量反应曲线是一种测定细胞接触不同浓度抗生素时的细胞毒性的有力工具。筛选抗性细胞所需的选择性抗生素的量因多种因素而异,包括细胞类型和抗生素类型。我们建议每次制作剂量-反应曲线时使用新的抗生素(或不同的品牌)或是使用不同的细胞系。

剂量-反应曲线测定的实验概要:

  1. 将细胞铺在一定数目的孔中,使得它们有25-30%的汇合度。这表明细胞仍在分裂,并对抗生素反应良好。
  2. 使用生长培养基稀释待测抗生素至推荐范围的广泛线性浓度。
  3. 从细胞中移去生长培养基。将含抗生素的培养基加到各自孔中,留一组孔空置不加。在这些空孔中加入不含抗生素的生长培养基。
  4. 在适当的生长条件下培养细胞(每隔3-4天更换一次培养基以去除死细胞,同时添加新鲜的含抗生素培养基)并每日观察细胞状态。在10-14天时,估算每孔中的活细胞数目。(这个时间周期取决于待测抗生素。抗生素如Geneticin、Hygromycin和Zeocin™需要大约3周杀死细胞,因此等待10-14天较为理想。而Blasticidin杀死细胞需要大约2周,等待7-10天即可。)为了达到这一点,移去培养基,用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞并用0.5%的亚甲基蓝和50%甲醇进行细胞染色20分钟。
  5. 将抗抗生素浓度的活细胞的数目的点绘图。这个曲线即是剂量-响应曲线或致死曲线。抗生素在所选时间段内杀死所有细胞的最低浓度就是接下来用于稳定筛选的浓度。

需要了解更多信息?敬请联系我们咨询 ›