microcentrifuge tube containing pink-colored liquid that is being withdrawn using a pipette

标记抗体使您可以研究固定并透化处理细胞中的几乎任意细胞靶标

由于其特异性及相对较容易制备,抗体成为了生物学研究人员的一种必备工具。

您可在本节了解直接及间接免疫荧光标记方法的利弊,领会选择一抗的基本注意事项。

浏览 使用二抗进行免疫标记 的实验方案

什么是免疫荧光?

免疫荧光是一种使用抗体对样本内特异性生物靶标进行荧光标记的技术。抗体是一种Y型的高分子糖蛋白,也被称为免疫球蛋白,它可以与其他分子(通常被称为抗原或表位)发生特异性(非共价)结合。在免疫荧光方法中,荧光标记的特异性来自于抗体结合抗原的特异性;而对已结合抗体的检测则使用可与抗体结合的荧光基团。

您也会发现免疫荧光也被称为免疫细胞化学(ICC)及免疫组织化学(IHC),有时也称为抗体标记。IHC通常指对薄组织切片中的标靶进行标记染色的实验,而ICC通常指对培养的细胞或者通过移除组织中原本的胞外基质分离得到的细胞进行染色。

图 1. 免疫荧光技术依赖于与荧光基团偶联的抗体,其可特异性结合特定标靶。本例图显示了抗体(灰色)与荧光基团(绿色)之间的偶联。实际上,商业化的偶联抗体其每一个分子都会由2-7个相同的荧光基团分子进行标记。

Y-shaped antibody molecule with a fluorophore bound to the Fc region

免疫荧光分析中使用的一抗和二抗

在讨论荧光成像时提到的抗体,一般会听到一抗或二抗,这些名词是指荧光标记抗体与感兴趣抗原结合的顺序。一抗直接与标靶结合,而二抗则以一抗作为靶向生物分子的桥梁,与之间接结合。

同时使用宿主物种及抗原物种命名抗体

在选择抗体时,您会发现如山羊抗小鼠,或驴抗山羊等词,有时要确保顺序正确是有点难度的。在这些名词中提到的第一种动物是指宿主物种,如制备抗体所用的物种。而在“抗”之后的动物名称则表示这种抗体识别的物种。要制备用于免疫标记的二抗,所用抗原通常是来自另一物种的抗体。所以山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 488是指一种识别小鼠免疫球蛋白的山羊抗体,其与发射波长488nm的染料偶联。

直接及间接免疫荧光方法的比较

直接与间接免疫荧光方法均具有不同优缺点,选择哪种方法进行免疫荧光成像取决于您的标靶及可以使用的一抗。一般来说,间接标记方法使用免疫荧光染料偶联的二抗是最常用的选择,也最具性价比,因为免疫标记的二抗相对来说更便宜,有多种颜色可供选择,可与任意可反应的一抗偶联,也可以进一步对信号进行放大,因为可以有多个二抗与一抗发生偶联。

fluorophores bound to the antibody

图 2. 免疫荧光标记可通过多种途径实现。与特异性抗原或表位结合的抗体显示为橙色。对于直接免疫荧光来说,与抗体结合的表位会被荧光基团(绿色)所标记;而对于间接检测或二级检测,一抗会与表位结合,随后荧光基团标记的可特异性识别一抗的二抗(紫色)则会与一抗结合。

直接免疫荧光

  • 直接标记所用的样品染色时间更短,流程更简单
  • 当对多个标靶进行特异性标记的多个抗体制备自同一物种时,直接标记方法可提供最佳的解决方案
  • 避免了二抗间的交叉反应

  • 荧光信号依赖于与单一抗体结合的有限的荧光基团数,因此仅限对于较高丰度标靶的检测
  • 实验流程灵活程度更低(可选颜色更少),价格更贵,且当没有商业化直接标记抗体时,实验更困难

间接免疫荧光或二级检测

  • 灵敏度更高,因为每个一抗可与多个二抗进行结合,从而放大了信号
  • 商业化制备的二抗相对更便宜,有多种光谱颜色可供选择

  • 具有潜在的交叉反应活性;在进行多重标记实验时,间接标记方法要求所用的一抗不能来自同物种
  • 二抗可能与组织样本中的内源性免疫球蛋白反应,从而使得背景荧光信号更强

一抗的选择

在规划免疫荧光实验时最重要的考虑事项是选择一抗,因为它是导致实验成败的主因。从商业化的一抗中选择的最佳方法是选择已知可用于免疫荧光实验的抗体。通常可在抗体描述或发表文献中查找到具体使用案例。可能的情况下,您会想选择与样品标靶来自同一物种的抗体。不过,这一点不是每次都可以实现的,而这也不意味您的实验注定失败。这只是表明您需要查看其他物种是否有与您的标靶氨基酸序列具有高度同源性的蛋白,然后从最具同源性的标靶中选择相应的一抗。

当在选择抗体时,需要提前考虑在同一实验中其他想要进行成像的标靶。如果要使用带有多种荧光颜色的抗体,应当确保避免使用从同一宿主物种中制得的多个一抗。例如,如果您使用了一种宿主动物为小鼠的未偶联的一抗,则需要确保所用的偶联二抗是在非小鼠的物种中通过抗小鼠抗体而制备得到的。如果有第二个标靶,还需要确定其一抗的宿主物种也不是小鼠,从而确保其他偶联二抗仅与一种一抗反应(而不是两种)。

primary antibodies raised in different host species are only bound by secondary antibodies specific for that host species

图 3. 对相同样品中的两个不同靶标同时进行二级检测依赖于每种靶标所对应的一抗是在不同宿主物种中制得的,从而可避免二抗间的交叉反应活性。


二抗的选择

一旦您选定了一抗,选择商业化的二抗要简单很多。选择与选定一抗宿主不同的物种制备二抗。若一抗是在小鼠体内制得的,需要选择小鼠以外的宿主物种制备二抗,例如山羊抗小鼠抗体,然后再与您希望用于成像的相应颜色荧光染料进行偶联。

疑难解答

有时使用偶联二抗的标准免疫荧光分析的信号强度仍然不够,这可能是由于一抗效果不好,这里的不好是指低亲和力或对标靶的特异性不高,或者靶标在样品中的丰度极低,使得偶联二抗对信号放大之后仍然太暗淡,很难观察得到。不论哪种情况,您都可以选择相应的放大方法来增强信号。

生物素-链霉亲和素信号放大是一种方法,可以使标记靶标的荧光基团数目增多。其缺点是需要进行额外的实验步骤来封闭内源性生物素以避免非特异性标记。

multiple fluorescent streptavidin molecules can bind to a single antibody

图 4. 使用荧光基团-链霉亲和素偶联物标记生物素化抗体,可使标记实验中的暗淡信号大大增强,因为每个抗体分子上会结合更多的荧光基团,同时表位的检测特异性也能得到保留。

另一种方法是使用酪氨酸信号放大方法,将二抗与可释放活性染料的酶偶联结合,这种染料可在存在 H2O2的情况下对抗体结合位点的周边区域进行标记。与生物素-链霉亲和素放大方法相类似,酪氨酸信号放大方法也在染色步骤中添加了额外步骤,同样需要对样品进行额外的封闭,以避免样品检测中出现不需要的强背景荧光信号。

enzyme-driven tyrosine signal amplification can boost the signal from a bound antibody

图 5. 酪氨酸信号放大可通过向每一表位添加更多的荧光基团来放大暗淡的信号,但是相应的标记特异性可能较低,因为具有反应活性的荧光基团也会与表位周围的区域发生结合。

Share