microcentrifuge tube containing colorless liquid that is being withdrawn using a pipette

荧光蛋白在活细胞成像应用中格外有益

通过对首先在自然界发现的荧光蛋白进行修饰,科研人员创造出了一系列在活细胞成像实验之中尤为有用的成像工具衍生物组合。

本节内容包含了有关如何为成像实验选择最适宜的荧光蛋白,如何设计FP融合蛋白,以及如何将其引入细胞的实验小贴士。

本节主题

使用荧光蛋白(FP)进行细胞成像

部分生物体会产生可自发荧光的蛋白质,科研人员便开发出了利用这些蛋白作为荧光显微研究工具的技术。在活细胞成像实验中,您可能希望进行延时显微成像以观察靶标如何在细胞内发挥功能,此类FP便是格外有益的工具。将FP基因融合到靶标基因之中,即可使FP结合成蛋白标志物。之后,宿主细胞即会制备出永久结合荧光标志物的靶标蛋白,因而也就无需再为样品添加荧光染料。第一种展现出了可作为细胞生物学工具资质的荧光蛋白是绿色荧光蛋白(GFP),其于上世纪60至70年代分离自Pacific Northwest jellyfish, Aequorea victoria 水母,但在上世纪90年代确定其完整的基因序列之前,一直未能作为显微生物学工具广泛使用。

jellyfish containing fluorescent body structures

图 1. Aequorea victoria水母,供图 Lyn Gateley/CC

  • 可提供从蓝色至远红外的颜色选择
  • 已有成千上万已发表的应用验证
  • 无需外源性底物即可发出荧光
  • 无论在单细胞还是整个生物体内(含哺乳动物)都有效
  • 无侵害性、无毒性

  • 在检测GFP成像的滤光片通道中,多数组织都能发出自发荧光
  • 固定之后荧光亮度可能会出现损失
  • 体积要比小分子染料大
  • 相对于其它染料,亮度更低

独特的荧光蛋白特性

现在我们已经从其他海洋生物(例如,海肾、珊瑚和海葵)之中分离出了多种FP。相对于GFP,很多此类FP都具有独特的性质,例如发射红光或发光颜色转化(从发绿光转换成发红光状态)。

underwater photograph of two jellyfish

求爱的维多利亚多管发光水母, 供图: Nadine Schaeffer/CC

GFP变体

  • BFP–Blue-蓝色荧光蛋白
  • CFP–蓝绿色荧光蛋白
  • GFP–原绿色荧光蛋白
  • EGFP–红移激发的增强型绿色荧光蛋白
  • EYFP–增强型黄色荧光蛋白
  • PA-GFP–光活性绿色荧光蛋白
underwater photograph of red coral

红珊瑚, 供图Nomore3Xfive/CC

非Aequorea victoria水母来源的FP

  • dsRed–珊瑚源荧光蛋白
  • mFruits–dsRed突变体
  • mCherry–常见的红色荧光蛋白
  • TagRFPs–Evrogen的全光谱FP系列
  • eqFP611–分离自拳头海葵(Entacmaea quadricolor)
  • Dronpa–光开关荧光蛋白
  • EosFP–光转换荧光蛋白

选择最适宜的荧光蛋白

如果您正在考虑制备用于荧光成像的荧光融合蛋白,GFP或者更具体地说,原始版本的维多利亚水母GFP增强版,即所谓的增强型GFP或EGFP便是您最佳的选择。这款荧光蛋白为单体、明亮、表现良好、无侵入性且几乎不会失效,其已经过反复验证,因此无论您选择何种生物体或应用,EGFP都是最理想的选择。

与此相反,如果您需要通过红色通道成像,则mCherry是最理想的选择。众多参考文献中提及了很多红色的FP,但是迄今还没有任何其他FP比mCherry的发表文献数目更多,比mCherry更适合Texas Red滤光片光立方。

Venus是一种极其明亮的单体黄色FP,但其并不能很好地适应标准的显微镜滤光片组,因此在您使用Venus时难免要在捕捉信号方面耗费很多的精力,尽管该光谱的蓝色末端很具吸引力,但坦白来讲,除非您的靶标丰度超高,否则您绝对不想使用大多数的蓝色FP,这是因为这一类FP所发出的荧光远较EGFP或mCherry微弱。

优化基因在荧光蛋白基因中的相对位置

最好将您的目的基因放置在DNA序列的3’端,或者放置之后FP融合的C端位置。结构和截短分析结果表明,GFP的N端非常容易被截断,而C端则相对更难截断,大多数FP,当然也包括来自于维多利亚水母GFP的FP——都具有“致软”C端,这就表示,在克服应5’或N端融合引起的位阻效应时,有着更大的自由度。因此,请将您的目的蛋白放置在FP的C端,以最大限度提高表达成功的概率。

3 prime end of of the fluorescent protein gene to produce a final protein

图 2. 目的基因的最佳位置就是处于荧光蛋白基因的C端。

将FP结构引入细胞

接下来,您需要选择将FP结构引入细胞的最佳方法。脂质体转染或病毒转导是最常用的方法。

荧光融合蛋白的常用领域

  • 追踪亚细胞基因产物的定位
  • 用于细胞信号传导通路的报告基因
  • 转染对照
  • 蛋白运输标志物
  • pH、氧化还原、钙离子及卤化条件的胞内传感器
  • Fusion proteins to elucidate function
  • 整个生物体研究的细胞类型标志物
neuron, visible because it expresses GFP

Figure 3A neuron expressing GFP, Photo by Jason Synder/CC

疑难解答

固定含GFP的细胞

通常情况下,可采用4%的多聚甲醛(PFA)在15分钟内固定细胞。在进行封闭/透膜步骤之前,用PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤若干次,但我们真正要讲述的技巧是,将您的PFA溶液的pH调至pH7.4。通常情况下FP,当然也包括大多数的GFP变体,都会在低于pH6.0的情况下失去荧光。具体操作请见固定,透膜和封闭 实验方案。

field of stained cells

检查并纠正GFP融合蛋白信号较弱的情况

最令人沮丧的事情莫过于,千辛万苦将自己的融合蛋白结构导入到细胞,结果发现GFP表达水平很低甚至没有表达。导致蛋白表达水平很低的因素包括与宿主生物体适应性很差的启动子、靶蛋白融合与GFP折叠的位阻效应,以及多聚体亚单位的表达(注定要在内质网内终止),甚至克隆错误。无论遇到什么情况,都不要灰心。

如果您发现荧光较弱,可以尝试采用抗GFP抗体放大所获得的信号。当然,为了使用这一类抗体,很可能要去固定样品,但是还可以调整GFP的颜色,例如,可以选用带有远红外荧光的二抗。

如果发现GFP结构无任何表达的迹象,则可以采用抗-GFP或抗靶标抗体进行一次免疫印迹分析。这一操作可帮助确定是否需要重新来过、重新检查序列,可能还要重新进行亚克隆步骤,或者帮助确定靶蛋白是否正在被快速降解,或者出现更为常见的情况——未能正确折叠。

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