疑难问题

使用了错误的检测通道观察样本

当您在目标通道的临近通道中发现荧光时,即可能发生了光串色现象,这一现象通常发生于使用多种荧光染料同时进行标记的实验中。

Cell image showing fluorescence from two different color dyes appearing in a single filter set, rendering them indistinguishable in the experiment.   图1.如果两个不同荧光基团的激发/发射光谱没有准确匹配到相应检测通道的滤光片组合,则来源于两者的信号就有可能出现在同一通道中。图中示例显示TRITC检测通道中检出的信号同时也出现在了FITC检测通道中。

这些HUVEC是通过ReadyProbes ActinRed™试剂染色的,过氧化物酶体则使用过氧化物酶体的一抗进行标记,随后通过Alexa Fluor 488荧光二抗检测。在本实验中,肌动蛋白通过TRITC检测通道进行成像,过氧化物酶体则通过FITC检测通道进行成像。上图中的结果是通过FITC检测通道获取的,可以很容易地看到过氧化物酶体上预期的荧光信号,但也可观察到来自肌动蛋白荧光标记的光串色。在这一示例中,肌动蛋白染色的荧光信号串色至FITC通道——这两种荧光基团在此实验中本不应该同时使用。

如何使光串色效应最小化

  • 合理地选择荧光染料和检测通道的滤光片组合,尽量为每一种您想用于成像的荧光染料选用最合适的滤光片。
  • 使用具有较窄发射光光谱的荧光染料也有助于抑制光串色效应。
  • 当设计使用多种荧光染料进行实验时,尽可能选择那些没有光谱重叠的荧光染料。例如,当您想用三种颜色进行标记时,可尝试使用分别匹配DAPI、FITC和Texas Red三个检测通道的染料。
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