疑难问题

信号开始时明亮但随着光照时间延长而衰减

许多荧光染料都可能在成像过程中发生荧光信号的光漂白效应。在成像实验期间,这种荧光基团的光化学破坏体现为荧光信号的衰减。

当您希望对较弱或丰度较低的靶标进行成像或尝试进行定量分析时,荧光衰减都可能造成不良影响。无论是何种形式的图像定量操作,都有必要将光漂白效应所造成的荧光衰减纳入考虑,因为它会对定量数据造成干扰,进而导致生成错误的结果。

Side-by-side stained cell images showing an intensely fluorescent image (right panel) that dims over time with exposure to illumination from the microscope (right panel).

图1.HeLa细胞被固定并用FITC偶联的鬼笔环肽标记。盖玻片使用50%甘油 (PBS) 封固;图 (A) 显示荧光染料的初始荧光,图 (B) 显示36秒持续光照射之后的光漂白效应(光淬灭)。

如何改进光漂白效应


尝试使用不同的染料

 

一些染料经过特殊调配具有更强的光漂白耐受性。如果您发现所选用的染料发生了很强的光漂白现象,或许可以在实验设置时尝试一些其他染料或新型染料看看效果是否更好。


尝试使用中性密度的滤光片

您也可尝试使用中性密度的滤镜降低照射样本的光子数量(但您的靶信号也会随之减弱),或改变显微镜的增益设置以使用更少的光线。唯一需要注意的是,当您需要对样本的成像结果进行对比时,应确保所有样本都采用了相同的设置。


最小化曝光程度

 

减少光漂白效应的最简单方法就是减小样本在激发光照下的曝光程度,可通过多种不同的方式实现这一目的:

  • 找到您希望成像的区域,并使用透射光进行对焦,然后使用荧光按需拍摄图像。
  • 找到样本目标旁边的一个区域,并使用荧光进行对焦,然后移至邻近目标视野并按需拍摄图像。
  • 找到希望成像的样本区域,但使用短于最佳的曝光时间进行对焦,也可结合使用像素组合技术以减少曝光时间。


建立光漂白曲线

 

某些荧光基团非常稳定,您无需过分担心光漂白效应;但也有一些荧光基团一点都不稳定;或者您也可能想专门观察荧光强度的微弱变化。在上述几种情况下,您可能都需要创建光漂白曲线,利用该曲线,您可以及时修正由光漂白造成的而非实验条件(如药物处理)所致的荧光强度损失。


使用可提供抗衰减保护的封片剂

如果您要对固定细胞进行成像,并想避免光漂白效应,则可选用一些商业封片剂对样本进行抗衰减保护,这些封片剂的保护效果主要取决于您使用何种荧光基团,您可能需要尝试不同的配方以找到最适合的一款,具体请参见封片剂部分。

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