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聚合酶

重组Taq聚合酶和天然Taq聚合酶的活性、特异性、热稳定性和PCR性能基本相同。但重组Taq聚合酶在细菌系统上表达和纯化,而天然Taq聚合酶直接从宿主体内纯化得到。

我们提供的Pfx50™ DNA聚合酶表现出了超出Taq DNA聚合酶50倍的保真度。

请见下面的比较表:

相对保真度 扩增长度 3'端A 尾
Taq 1 <5 kb +
Platinum® Taq 1 <10 kb +
AccuPrime™ Taq 2 <5 kb +
Platinum® Pfx 26 <12 kb -
AccuPrime™ Pfx 26 <12 kb -
Pfx50™ 50 <4 kb -
Platinum® Taq HiFi 6 <20 kb +/-
AccuPrime™ Taq HiFi 9 <20 kb +/-
AmpliTaq® 1 <5 kb +
AmpliTaq Gold® 1 <5 kb +
AmpliTaq Gold® 360 1 <5 kb +

Taq酶错配率:1 x 10-4至2 x 10-5碱基/每次复制

是的,可以用具有校读功能的聚合酶进行PCR反应。但在进行TA克隆之前,您需要在PCR产物3'端添加A尾。

我们会建议您使用我们的AccuPrime™GC-Rich DNA聚合酶,它是针对高GC含量模板(GC 含量>65% )而开发的。此外,您可以用PCRx Enhancer系统配合DNA聚合酶(其中包括天然/重组Taq、Platinum® Taq、以及 Platinum® Taq 高保真聚合酶)一起使用,以扩增高GC含量和较难扩增的模板。最后,经研究证明,含有360 GC Enhancer缓冲液的AmpliTaq Gold® 360可以用于GC含量高达80%的模板。

我们强烈建议您使用MgSO4。尽管MgCl2在某些情况下也有效,但MgSO4通常可以获得更加稳健、可重复的产物——因为硫酸根是最适于Platinum® Taq高保真聚合酶的阴离子。

使用Platinum® 技术时,在94°C的变性步骤之前,抗DNA聚合酶的抗体结合在酶上。在变性步骤中,抗体将随之降解,聚合酶活化,引物开始介导延伸。AccuPrime™ Taq将Platinum®Taq (Taq + Platinum®抗体) 与我们专利的热稳定 AccuPrime™ 辅助蛋白相结合。10x反应缓冲液中包含了该辅助蛋白,以提高每轮PCR反应中引物和模板结合的特异性。

The 10X PCR buffer for Platinum® Taq is not available as a stand-alone item. It is only supplied as part of the enzyme kit.

Yes, the Platinum® Multiplex PCR master mix contains Platinum® Taq DNA Polymerase that leaves A overhangs on PCR products.

AmpliTaq Gold®和Platinum® Taq都是热启动酶,均支持在无冰的情况下在实验台上配制反应体系。AmpliTaq Gold®是一种化学修饰的热启动酶,以非活性状态提供。在95°C下,该酶可在10分钟后完全热激活。Platinum® Taq是一种抗体介导的热启动酶。抗Taq抗体会与酶结合并抑制酶的活性,直至PCR反应的热变性阶段(30秒到2分钟),该酶的活性才被激活。

是的,该酶混合物会使一部分PCR产物留下3′端 A尾。然而相对于单独采用Taq聚合酶,克隆效率会大幅度下降。建议在PCR产物添加3′端 A尾后再进行TA克隆。

就我们的经验来看,Gold Buffer有最好的性能。这三种缓冲液各自的配方如下:
GeneAmp® 10X PCR Buffer:100 mM Tris-HCl,500 mM KCl,15 mM MgCl2,pH 8.3, 0.01% (w/v) gelatin
GeneAmp® 10X PCR Buffer II*:100 mM Tris-HCl,500 mM KCl,pH 8.3
GeneAmp® 10X PCR Buffer Gold*: 150 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, pH 8.0
*缓冲液配有单独的 MgCl2 溶液 (25 mM).

PCR反应

PCR的主要步骤是:变性、退火、延伸。通常情况下,需要将模板加热到较高温度(大约94-95°C)使双链DNA变性成为单链。然后,将温度降到50-65°C,使引物退火到模板上互补的碱基配对区域。之后,再将温度升高到72°C,使聚合酶结合到模板并合成一条新DNA链。

热启动是一种可防止DNA在不恰当的时机出现扩增的方法。为此,您可在冰上建立PCR反应,从而防止DNA聚合酶一开始便处于活性状态。更简单的做法则是使用一种“热启动”酶——这种酶在供应时为非活性状态,高温加热步骤之后才会活化。

MgCl2浓度应针对每种模板和引物对进行优化。一般而言,终浓度介于0.5-2.5mM之间(使用0.2mM 的dNTP时)。注意:EDTA或过量dNTP会螯合Taq DNA聚合酶活化所必需的镁离子,进而抑制扩增。

尽管实际体积取决于用于第一链合成反应的RNA起始量和靶标基因的丰度,但我们建议使用10%的第一链cDNA反应产物进行PCR反应。

降落PCR指的是每经过一个循环,退火温度都下降1°C,直至设定的“降落”退火温度,并且余下的循环都使用这个降落退火温度。降落PCR会增加特异性并减少背景扩增。以高退火温度开始PCR反应时,只会扩增您感兴趣的基因,从而使您可以积聚靶标产物。在接下来的PCR循环中降低退火温度,则可使特异性模板得到有效扩增。

巢式PCR需要两次独立的扩增 - 第一次用一组PCR引物,而第二次使用内部的“巢式”引物 及 1%或更少的第一次PCR反应产物作为模板。如果靶标丰度太低,或者同时产生非特异性PCR产物与特异性产物,可以使用巢式PCR。而当序列信息很有限,仅能设计第一次PCR产物一端的内侧引物时,可以使用半巢式PCR,例如RACE(cDNA末端快速扩增反应)。

通常情况下,引物的退火温度应该比引物熔解的最低温度要低3-5°C。如果温度过高,引物的退火效果就不佳;如果温度过低,会出现非特异性退火。

高GC含量的模板通常具有较高的熔解温度,在正常的反应条件下可能不能完全变性。

您可以尝试加入5%-10%的DMSO、至多10%的甘油或者1-2%的甲酰胺,或者联用这些方法促进这些难扩增模板的扩增。注意:使用助溶剂会降低您的引物的最佳退火温度。

退火温度相对较高时,您可以选择使用双温度实验方案。此时,退火和延伸步骤放在一起进行,例如,两者都可在>62°C的温度下发生。相对常规的三温度实验方案(三步法),双温度实验方案的优势是速度快得多。

引物和寡核苷酸

以下指导原则可能有助于您设计自己的PCR引物:

  • 通常来说,引物长度以18-30个核苷酸为佳。
  • 可尽量使引物的熔解温度(Tm)处在65°C到75°C之间,同时确保引物间的熔解温度差值在5°C之内。
  • 如果您的引物的Tm非常低,可尽量找一段高GC含量的序列,或者稍微延长一下引物的长度。
  • 尽量保证GC含量在40%到60%之间,同时确保引物的3’末端为C或G,从而促进结合效率。
  • 通常情况下,可在引物的限制性内切酶位点的5’末端增加3-4个核苷酸,促进有效地酶切。
  • 尽量避免出现二级结构区域,同时确保富含GC和富含AT的区域分布均衡。
  • 尽量避免连续出现4个及以上的相同碱基,或者某两个核苷酸连续重复出现(例如,ACCCC或ATATATAT)。
  • 避免引物内同源性(引物内有超过3个碱基互补)或引物间同源(正反向引物间有互补序列)。这些情况会引起自身二聚体或引物二聚体,而不是退火到所需的DNA序列上。
  • 如果您使用引物进行克隆,建议纯化水平至少达到柱体纯化的水平。
  • 如果您采用引物进行突变研究,请尽量将错配碱基放在引物序列的中间位置。
  • 如果您使用引物进行PCR反应,然后再进行TOPO®克隆,则引物不应该有磷酸化修饰。

如需了解更多关于引物设计的提示和工具,请点击此处

有的。OligoPerfect™ Designer即可为测序、克隆或检测等应用设计引物。

将装寡核苷酸的离心管离心几秒钟,使寡核苷酸聚集到离心管的底部。小心打开离心管,以适当体积的TE(10 mM Tris-HCl,pH 8.0,1 mM EDTA)溶解寡核苷酸。推荐使用TE而不是蒸馏水溶解,因为水的pH通常是弱酸性的,会导致寡核苷酸水解。最好用移液器上下吹打该溶液至少10次。如需了解引物浓度和重悬体积计算方法,请点击访问此网页

Life Technologies™公司的寡核苷酸是冻干形式提供的。冻干(以及重悬)的寡核苷酸建议在-20°C下储存。冻干的寡核苷酸在-20°C下至少可以稳定保存1年。溶解在TE中的寡核苷酸在-20°C 或4°C下至少可以稳定储存6个月。在没有核酸酶的情况下,溶解在水中的寡核苷酸在-20°C下可以稳定储存6个月。冻干的寡核苷酸在室温下可至少稳定放置几个月。在-20°C下储存的浓度大于10 μM的寡核苷酸溶液,可以稳定放置至少6个月。如果寡核苷酸储存在4°C下,则务必将它们重悬在TE缓冲液而不是水中。(注意:在4°C条件下的水中,寡核苷酸会随着时间推移而水解)。AP和HRP偶联物放置在它们各自的储液中发货。请将它们储存在4°C条件下。

根据您的具体应用,可能需要不同的纯化水平。请参考此表格

寡核苷酸采用DNA合成仪制备,后者大致相当于一个计算机控制的试剂递送系统。第一个碱基附到固相支持物上——此类固相支持物通常是玻璃或者聚苯乙烯珠子——用于将延伸的DNA链固定到反应柱上。DNA合成包括一系列的化学反应。

  1. 去封闭: 第一个碱基通过一个化学连接臂附着到固相支持物上,然后去除三苯甲基保护基团,进而产生一个游离的5’ OH基团,以便与下一个碱基反应。
  2. 偶联: 加入下一个碱基,偶联到前一个碱基上。
  3. 加帽:任何未能成功偶联反应的将被盖帽。这些未能反应的碱基将不再参与进一步的合成循环。
  4. 氧化:前一个碱基和成功连接上的后一个碱基之间的连接亚磷酯键将被氧化保证链的稳定增长。
  5. 去封闭:脱掉之前加入碱基的5’端三苯甲基基团,以暴露5’羟基,供下一步缩合继续新增碱基。

合成的规模是合成的起始用量,而不是担保的终产量。我们以最小OD单位保证寡核苷酸的总得率。您可 点击此链接查看我们提供寡核苷酸时所担保的最低得率。

偶联效率是影响合成DNA长度的主要因素。碱基组成和合成规模也有影响作用。在99%的偶联效率下,合成95-mer的粗溶液中将包含38%的全长产物和62%(nx)的失败序列。这一数字尚未将脱嘌呤作用等其他化学效应考虑在内。脱嘌呤作用主要影响A碱基。脱嘌呤的频率很低,但会随着引物长度的增加而显著增加。鉴于此,我们规定核苷酸的最大长度是100个碱基,我们也认为这是可确保能够进行常规、经济地合成的最大长度。

偶联效率是评价DNA合成仪将新碱基添加到逐渐延伸的DNA链上的效率的指标。如果DNA链上每个可用碱基都与新碱基成功反应,则偶联效率为100%。不过很少有化学反应能够实现100%的效率。在DNA合成过程中,可实现的最高偶联效率通常在98%到99%之间(通常是99%)。这意味着在单个偶联步骤中,DNA链上1%至2%的可用碱基未能与新加的碱基发生反应。全长寡核苷酸占合成产物的百分比可通过偶联效率的n次方(n为引物长度,即循环数)来进行估算,如长度为22的寡核苷酸,可获得0.9922 x 100% = 80%的全长引物。您可以将引物进一步纯化,从而获得含量为95%的全长寡核苷酸产物。对于较长的寡核苷酸,强烈建议您进行纯化操作。举例来说,一个64-mer的引物,在合成过程中将只能获得0.9964 x 100% = 53%的全长寡核苷酸。而且这还需要每一偶联循环的效率都达到99%才能实现。

三苯甲基基团与DNA碱基相连时是无色的,一旦从碱基上去除则呈现橙色。该颜色的强度可通过紫外分光光度计测得,且与存在的三苯甲基分子数量直接相关。通过比较整个合成过程中释放的三苯甲基的吸光值,可以计算出成功偶联的碱基比例,进而获得偶联效率。

在DNA合成过程中,偶联效率是一个重要因素,这是因为其影响具有累积效应。下表显示了1%的偶联效率差异所引发的效应,以及在不同长度寡核苷酸合成过程中,该种差异对全长产物的得率造成的影响。即使是合成相对较短的20个碱基的寡核苷酸,哪怕偶联效率存在1%的差异,也会造成全长产物得率相差15%以上。

添加的碱基数量 99%偶联效率下的全长产物的百分比 未能合成全长产物的百分比 98%偶联效率下的全长产物的百分比 未能合成全长产物的百分比
1 99 1 98 2
2 98.01 1.99 96.04 2.96
3 97.03 2.97 94.12 5.88
10 90.44 9.56 81.71 18.29
20 81.79 18.21 66.76 33.24
30 73.79 26.03 54.55 63.58
50 60.5 39.5 36.42 63.58
95 38.49 61.51 14.67 85.33

全长寡核苷酸的百分比取决于化学合成的偶联效率。此类化学合成的平均偶联效率接近99%。计算全长寡核苷酸的百分比时,可采用以下公式:0.99n-1。因此,离心管里79%的寡核苷酸分子长度是25碱基,其余的寡核苷酸长度则<25个碱基。如果您关心如何着手制备全长核苷酸,可以考虑采用柱体纯化、PAGE或HPLC纯化。

查看此列表了解我们所提供的标准修饰选择。如果您未能找到自己想要的修饰选项,请发送邮件到CNtechsupport@lifetech.com 联系我们的技术支持团队,询问我们是否能够满足您的要求。

Unless you specifically request that primers be supplied in solution, they are shipped lyophilized. We recommend reconstituting them in the appropriate volume of TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0).

We offer TE Buffer, pH 8.0 (Cat. Nos. AM9849 and AM9858), that consists of 10 mM Tris (adjusted to pH 8.0 with HCl) and 1 mM EDTA.

Yes, we can synthesize primers with degenerate bases. Click here for the electronic ordering code to use.

No, the primer will not have this modification. You must specify that it should have a 5’ phosphate modification.

计算引物Tm的常用公式如下:

Tm (°C) = 2 (A+ T) + 4 (G + C)

引物的一个重要参数是熔解温度Tm。Tm是指在该温度时,有50%的引物与其互补序列以双链DNA分子的形式存在。Tm是确定PCR退火温度的必要条件。合理的退火温度范围介于55°C到70°C之间。退火温度通常比引物的Tm低5°C。因为绝大多数公式提供的是预估的Tm值,所以这里的退火温度只是作为一个起始温度进行尝试。在逐渐增加退火温度的条件下进行多次反应并分析,可以增加PCR的特异性。

高GC含量的模板通常具有较高的熔解温度,在正常的反应条件下可能不能完全变性。

您可以尝试加入5%-10%的DMSO、至多10%的甘油或者1-2%的甲酰胺,或者联用这些方法促进这些难扩增模板的扩增。注意:使用助溶剂会降低您的引物的最佳退火温度。

退火温度相对较高时,您可以选择使用双温度实验方案。此时,退火和延伸步骤放在一起进行,例如两者都可在>62°C的温度下发生。相对常规的三温度实验方案(三步法),双温度实验方案的优势是速度快得多。

Value Oligos是最经济、快速的寡核苷酸订购方法。其可以选择5-40mer、25或50纳摩尔规格,同时包含了一系列可满足您需求的纯化选项,且可实现次日发货(仅适用于美国客户)。其订购费用按照每条寡核苷酸而不是每个碱基来计算。Value Oligos不提供修饰选项。Value Oligos与我们的标准寡核苷酸采用相同的生产流程,有着相同的质控标准。

因为随着寡核苷酸长度增加,在从正确的产物中分离出合成失败的寡核苷酸时,柱体纯化方法的效率会越来越低。在这种情况下,PAGE纯化是相对理想的选择。

Tm值并不是绝对的——它们是实际存在的熔解温度范围的一个近似值。对于一条给定的寡核苷酸,熔解温度不仅与盐的含量有关,也与碱基组成和在反应液中不能精确定量的引物浓度有关,熔解温度范围会存在10-15度的波动。您不应仅仅使用某个给定Tm值进行实验。Tm是指在该温度时,有50%的引物与其互补序列以双链DNA分子的形式存在。Tm是确定PCR退火温度的必要条件。合理的退火温度范围介于55°C到70°C之间。退火温度通常比引物的Tm低5°C。因为绝大多数公式提供的是预估的Tm值,所以这里的退火温度只是作为一个起始温度进行尝试。在逐渐增加退火温度的条件下进行多次反应并分析,可以增加PCR的特异性。

在整个平板形式的订单中,96孔板每板平均不少于24条寡核苷酸;384孔板每板平均不少于192条寡核苷酸。

对于25、50和 200 nmol的脱盐和柱体纯化的DNA寡核苷酸,100% 通过A260 分析进行质控。此外随机选取25%的寡核苷酸产物样品进行毛细管电泳或质谱检测。对于用户订购的25和50 nmol规格的脱盐DNA寡核苷酸,其分析过程中还100%执行实时数字三苯甲基监控。对于用户订购的1和10 μmols规格脱盐DNA寡核苷酸,全部规格的HPLC和PAGE纯化的DNA寡核苷酸,大多数含有3’端和/或5’端修饰的DNA寡核苷酸,以及RNA寡核苷酸都会100%执行 A260分析、毛细管电泳或质谱检测。

不,我们不保证有50/50的混合碱基。例如如果需要混合GC碱基,我们的合成仪会使用正常数量一半的G碱基和正常量一半的C碱基。这一计算并未将偶联效率考虑在内。因此,可能会出现30/70的碱基混合物。

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