您是否在实验过程中遇到麻烦?

我们致力于为您的成功保驾护航,让一切回归正轨。欢迎浏览我们的专家建议,了解常见问题的应对方案。

查看以下的相关问题:

初次接触此类实验吗?
敬请浏览我们的

入门页面

更多信息敬请浏览我们的
常见问题解答(FAQ)数据库 ›

聚合酶链式反应(PCR)

以下有几点建议:

  • 确保引物在3’末端没有互补序列。
  • 试试热启动聚合酶。
  • 通过将退火温度递增2-5℃并最大限度缩短退火时间来优化退火步骤。你可以尝试在前几个循环中使用较高的退火温度,然后在后续的循环中降低退火温度。
  • 针对每种模板和引物组合优化镁离子浓度。
  • 试试巢式PCR。

出现拖尾效应时,可以确认有无以下几点原因:

  • 酶、引物、镁离子浓度以及/或者dNTP浓度过高。
  • 退火温度相对所用的引物来说过低。
  • 循环次数太多。
  • 退火和延伸的时间太长。
  • 引物设计不佳或存放时间过久。
  • 最初使用的模板太多,可试试以104-106个拷贝的模板量起始。
  • 可以考虑使用添加剂或者 PCR OptimizerTM试剂盒(货号K122001), ,尤其在当您使用Taq酶扩增时,您觉得引物应该有效,或者之前用过有效的前提下特别推荐进行这样优化。

请查看我们关于如何增加得率的以下几点建议:

  • 在PCR之前不要使用木质牙签挑取克隆或从胶上挖出DNA。有报道表明这种做法会抑制PCR反应[Lee (1995)Bio Techniques 18:225]。
  • 没有使用足够的酶。
  • 变性/延伸温度太高,酶过早失活。
  • DMSO过量(>10%)。
  • 退火温度有误:从低于计算的Tm值5度的温度开始,用不同的退火温度来进行一系列反应。
  • 循环次数太少。
  • Mg2+不足或过多。
  • 引物设计不佳:再次确认引物序列与模板序列,引物对应该有相似的解链温度,避免引物3’末端有互补序列。
  • 遗留抑制剂(如血液、血清)。
  • 变性时间过短。基因组DNA和病毒DNA可能需要10分钟的变性时间。
  • 相对于所扩增产物的大小,延伸时间可能不足。
  • 使用超辐射(>2500mj/cm2的强度处理)矿物油可能抑制或者降低PCR产物的得率[Dohner (1995) Biotechniques 18:964]。
  • 模板有一长串的CG序列[Woodford et al. (1995) Nucleic Acids Res 23:539声称,从扩增反应中去除所有的钾成分,模板中的富GC区域就足以解链,从而达到可进行PCR的程度]。此外, 1.0M三甲基甘氨酸与6%-8%的DMSO或5%的DMSO与1.2-1.8M三甲基甘氨酸的组合,均可用于扩增富GC模板[Baskaran (1996) Genome Res 6:633]。
  • 若存在其它Taq DNA聚合酶抑制剂(如靛蓝染料、亚铁血红素、黑色素等),可以向PCR体系添加牛血清白蛋白(BSA)(约160-600μg/mL)、增加Taq酶的总量、和/或者通过增加PCR的体积来稀释抑制剂。加入的BSA浓度可能取决于存在的抑制剂含量及类型。此外,无脂肪酸、乙醇沉淀的BSA或Fraction V BSA应该全部都有效。

以下一些原因可能造成您的PCR实验失败:

  • 存在50mM的NaCl,抑制了酶的活性。
  • 反应体系有太多KCl。KCl含量不应超过50mM。
  • 使用的退火温度有误。
  • 变性不完全(时间必须足够长,温度必须足够高)。
  • 模板有一长串的GC序列[Woodford et al. (1995) Nucleic Acids Res 23:539声称,从扩增反应中去除所有的钾成分,模板中的富GC区域就足以解链,从而达到可进行PCR的程度]
  • 存在10%的DMSO,部分抑制了Taq聚合酶活性。
  • (血液样本)存在氯高铁血红素,抑制了Taq聚合酶活性。
  • 使用超辐射(>2500mJ/cm2的强度处理)矿物油可能抑制或者降低PCR产物的得率[Dohner (1995) Biotechniques 18:964]。
  • 在PCR之前不要使用木质牙签挑取克隆或从胶中挖出DNA。有报道表明这种做法会抑制PCR反应[Lee (1995)Bio Techniques 18:225]。
  • 存在其它Taq DNA聚合酶抑制剂(如靛蓝染料、亚铁血红素、黑色素等)。可向PCR体系添加牛血清白蛋白(BSA)(约160-600μg/mL)、增加Taq酶的总量、和/或者通过增加PCR的体积来稀释抑制剂。

这种情况可能存在的原因和我们提供的建议如下:

  • 引物设计:可试试更长的引物以避免结合到其它位点,避免3’端存在3个连续的G或C核苷酸。
  • 退火温度:可增加退火温度以增加特异性。
  • 镁离子浓度:试试降低镁离子浓度。
  • DNA污染:可使用防气溶胶的枪头并隔离工作区域以避免污染,可使用UNG/UDG技术来防止前次PCR产物遗留。

循环次数太多或者在反应体系中加入太多DNA时,会出现这种残留物。可以试试在上样之前把样品加热到65度,然后再放到冰上。

引物及寡核苷酸

定制规格指的是开始合成的规格,或者用来合成您的寡核苷酸的起始材料量。根据纯化水平和效率,你将获得比原始合成规格更少的得率。然而,根据起始合成的规模,我们确实有一个最低得率保证,你可以 点击此处查看。.

该寡核苷酸可能没有完全溶解。在加入TE缓冲液后,确保寡核苷酸震荡混匀30秒,并且/或者用移液器吹打10次以上。引物可能会粘在离心管的壁上,所以在重悬寡核苷酸时,也应该“冲洗”离心管壁。

务必要区分寡核苷酸生产过程中与化学性质相关联的自然出现的突变,和某些应用中用到的脱盐纯化的寡核苷酸中发生的可预知的突变。

寡核苷酸化学合成本质上不可避免出现自然发生的突变,在给定的30个碱基左右的寡核苷酸中出现单个核苷酸插入或缺失的几率差不多有2%。Invitrogen公司很乐意为您更换这一类型的任何寡核苷酸。

对于可预知的突变,在DNA合成后,通过在诸如氢氧化铵等碱性溶液中的孵育,会有完整的DNA链从固相支持物中脱离开来。这一类溶液包含所需的全长寡核苷酸,但也包含了合成失败产生的DNA链(失败的序列)。如果您的目标是合成30-mer的产物,该溶液将可能包含29-mer、28-mer、27-mer等等规格的失败产物。失败序列的量受偶联效率影响。对于这种类型的寡核苷酸,假设有99%到98%的偶联效率,则全长核苷酸的比例将在74%到54%之间。在合成更长的核苷酸时,这一比例甚至会更低。

由于寡核苷酸从3’端到5’ 端合成,脱盐引物没有针对长度进行纯化,将会漏掉5’端的碱基。因此,我们只推荐将脱盐的寡核苷酸用于诊断性PCR、微阵列或测序。Invitrogen公司建议,如果需要将寡核苷酸用于某些高要求的应用(如诱导突变或克隆),应对寡核苷酸进行纯化,尤其是限制性位点加在5’端时。

对于脱盐及经过纯化的寡核苷酸,其它可以预计的突变来源有测序人为误差、PCR过程中引入的位点突变、引物中不稳定的茎环结构、质粒DNA在克隆到大肠杆菌菌株(如muS、mutD或mutT等)后增殖以及菌株密码子选择引起的沉默突变选择。

为了实现全长寡核苷酸序列,建议您使用纯化水平更高的寡核苷酸。增加限制性内切酶位点,会使20-25-mer的寡核苷酸上增加10个或者更多的碱基,使引物长度超过30个的碱基,同时使脱盐后全长序列的百分比会相对较低。此外,引物合成寡核苷酸时从3’末端合成到5’末端,序列的5’末端会出现失败序列。因此,在引物5’末端引入的限制性内切酶位点可能因为效果不佳,导致碱基缺失。

生产引物时,可能会在任何一轮的寡核苷酸延伸反应中出现两种可能性:

  1. 新增的碱基没有正确地脱三苯甲基,少增加了一个碱基,但是却可以进行下一轮反应延伸。
  2. 三苯甲基被去除了,但在加入下一个碱基之前没有偶联或者正确盖帽,因此寡核苷酸链可继续延伸。

如果脱三苯甲基没有正确出现,并且/或者如果合成仪出现错误并递送错误的碱基,则会在你的引物上出现一个额外插入的碱基。如需帮助,请联系 techsupport@lifetech.com

大多数情况下,颜色不会影响PCR或者其它实验应用,这通常是由于合成过程中使用的碘引起的。然而,也有一些例外情况。引物过度干燥可能引起寡核苷酸发棕色,如果出现这样的情况,引物可能就失效了。

如果寡核苷酸看上去是绿色的,最有可能是墨水落入离心管中。该寡核苷酸应仍然是具有功能的。您可通过乙醇沉淀法去除该颜色。

如果寡核苷酸受热过度,它看上去就像一个“球”状沉淀附在管子的底部。这应该不会影响到寡核苷酸的质量,并且该寡核苷酸应该是易溶于水的。

引物的干燥方法会使其附在管壁上形成一个薄层而不是附在底部,因此并不是总能看到沉淀,这种情况下产品仍可以正常使用。

在进行PCR之前应将引物按单次使用的量分装。将分装的引物在94度下加热1分钟。在加入PCR反应体系前快速在冰上冷却引物。有些引物可能会自己退火或者自己蜷缩起来。

寡核苷酸应该在含有7M尿素的聚丙烯酰胺凝胶上检测,并且应该与50%的甲酰胺溶液一起上样以避免压缩和形成二级结构。长度相同但是组成不同的寡核苷酸可以产生不同的电泳结果。dC的迁移最快,其次是dA、dT,最慢的是dG。带有核糖核酸的寡核苷酸容易产生模糊的电泳条带,并且通常存在二级结构问题。

如需更多信息,敬请联系我们 ›