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siRNA概述

根据您的目的基因,在转染后数小时即可测定mRNA水平。我们建议在转染48小时后检测mRNA的敲低效果。影响检测时间的因素包括转录活性,信使RNA的降解速度,以及是否存在替代通路。要确定敲低的峰值,最好进行一个时间梯度实验。

请参考以下可能的原因和建议:

  • 是检测的mRNA水平吗?最可靠的方法是实时PCR。在一些情况下,即使mRNA已经被敲低,蛋白的敲低效果也可能会受蛋白降解速率等其它变量的影响。
  • RNA是如何提取的?检测提取的RNA的质量了吗?应确保RNA没有降解。
  • 使用阳性对照了吗?这可以帮助确定试剂是否有效以及siRNA是否被正确递送进细胞。请在进行实验的同时使用阳性对照siRNA。
  • 使用转染对照了吗?被转染细胞的百分比是多少?
  • 进行不同时间的检测了吗?通常,基因沉默可以早在转染后24小时测定。但是,基因敲低的持续时间和程度取决于所用的细胞类型和siRNA的浓度。
  • 优化过转染条件吗?您可以尝试使用不同的细胞密度和siRNA浓度。
  • 您使用了多大浓度的siRNA?我们建议测试 5 nM到100 nM之间的多个浓度。

请参考以下可能的原因和建议:

  • 您测试了多少个siRNA?有任何敲低效果吗?如果所有siRNA都没有敲低效果(<10%),那么可能是检测方法本身的问题。试试使用其他qRT-PCR assay评估敲低效果。
  • qRT-PCRassay的靶位点和siRNA切割位点的相对位置如何?如果两者相差3,000碱基以上,问题可能是其它剪接转录本的存在造成的。
  • 实验的Ct值是多少?在40循环的qRT-PCR实验中它们应该低于35。
  • 您确定siRNA转染进入细胞中了吗?我们建议使用一个经过验证的阳性对照siRNA来检查转染效率。

在一些情况下,即使mRNA已经被敲低,蛋白的敲低效果也会受蛋白降解速率等其他变量的影响。另外,相比于mRNA,蛋白可能需要更长的时间才能看到敲低效果。

我们建议进行一个转染试剂对照实验,确定您的细胞是否对转染试剂敏感。此外,您可以尝试其他细胞密度和siRNA浓度以减少转染本身的毒性。请访问我们的转染支持中心获取更多关于转染的问题排查信息。

请查看下列内容:

(a) Silencer Select: “ThermoFisher Scientific”向您担保,如果您针对同一靶基因购买了两条预设计的Silcencer SelectsiRNA,这两条siRNA对靶基因mRNA的敲低效果均能够达到70%或更多。此担保的前提条件是,siRNA转染的终浓度必须≥5nM,且在转染后48小时测定mRNA水平。建议采用实时定量RT-PCR技术检测mRNA水平,但不做强制性要求。客户还必须提供阳性对照的有效敲低结果,从而证明转染效率是足够的。如未能检测到我们承诺的敲低水平,而阳性对照的结果是成功的,我们将会免费为您合成一条新的Silencer Select siRNA。此担保未延伸至任何换货产品。”

(b) StealthRNAi: “ThermoFisher Scientific”向您担保,如果您针对同一靶基因购买了三条预设计的stealth siRNA,这三条独立的非重叠的siRNA之中至少有两条对靶基因mRNA的敲低效果能够达到70%或更多。此担保的前提条件是,siRNA转染的终浓度必须≥20 nM,且在转染后48小时测定mRNA水平。建议采用实时定量RT-PCR技术检测mRNA水平,但并不是强制的。客户还必须提供阳性对照的有效敲低结果,从而证明转染效率是足够的。如果未能检测到我们承诺的敲低水平,而阳性对照的结果是成功的,我们将会免费为您合成一条新的StealthsiRNA。此担保未延伸至任何换货产品。我们还建议您使用适当的阴性对照(如三种Stealth™ RNAi阴性对照之中的一种)来标准化mRNA敲低水平。”

(c) Silencer: “ThermoFisher Scientific”向您担保,如果您针对同一靶基因购买了三条预设计的SilencersiRNA,其中至少有两条能够将培养细胞内的靶基因mRNA水平降低70%或更高(转染时siRNA的终浓度≥100 nM,转染后48小时检测,实验条件如下所述)。如果三条之中至少有两条对靶基因mRNA的敲低效果未能达到70%以上,ThermoFisher Scientific将会免费一次性更换每个基因最多三条预设计的SilencersiRNA。产品更换申请必须在预设计的SilencersiRNA发货后一百八十(180)天内提出。您必须遵照良好的实验操作和靶向内源基因的经验证的siRNA(例如,Ambion Silencer GAPDH对照)来确保最佳的转染效率。为了评估敲低效果,预处理样品内靶基因的mRNA水平,必须与转染不靶向任何基因的对照siRNA(例如 Silencer阴性对照1)的细胞内的靶基因mRNA水平进行比较。我们建议采用TaqMan基因表达assay定量mRNA水平。”

所有经验证的siRNA每条均有质保条款,保证其对目标mRNA的敲低效果达到80% (Silencer) 或 70% (Stealth RNAi).

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