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siRNA载体

载体介导的技术使您能够:

  • 实现瞬时或稳定的靶点敲低
  • 在所有细胞类型中实现RNAi,甚至是难转染、原代和不分裂细胞
  • 通过siRNA的诱导表达,调控基因抑制效应
  • 可以筛选稳定表达某个siRNA序列的单一细胞群
  • 利用组织特异性启动子控制体内基因表达

请查看将siRNA模板克隆进入pSilencer™载体的建议

请访问我们的转染支持中心,查找关于转染的技术资源、使用技巧以及问题排查信息。

shRNA RNAi载体

为实现有效的shRNA表达,应使用Pol III型启动子。这些Pol III型启动子包含表达RNA所有必需的上游启动子元件,并以一个较短的多聚胸腺嘧啶束终止。一旦shRNA开始表达,它们便被运输出细胞核并在胞质中被Dicer酶加工成siRNA。Dicer酶优先识别Pol III型启动子生成的shRNA,因为它们不带有5’或3’侧翼序列。siRNA进入RISC复合物并在哺乳细胞中产生RNAi效应。

短发夹RNA(shRNA)是一种人工设计的RNA分子,可通过与RNAi和miRNA通路中常见的细胞成分相互作用而诱导基因沉默。尽管shRNA在结构上是miRNA的一种简化形式,但shRNA分子诱导RNAi效应的方式与siRNA相似,即诱导目标转录本发生断裂和降解(Brummelkamp et al,2002;Paddison et al,2002;Paul et al,2002;Sui et al,2002;Yu et al,2002)。RNA聚合酶III(Pol III),如U6和H1,可驱动shRNA转录本的转录。发夹结构的shRNA离开细胞核并被Dicer酶加工后输送到细胞质,形成siRNA。

外源性短发夹RNA可在RNA聚合酶III的作用下发生转录(Paule&White,2000),它通常具有以下结构特性:

  • 来源于目标基因的19–29个核苷酸的短序列,紧随其后的是
  • 4-5个核苷酸的短分隔序列(即,茎环)以及
  • 19-29个核苷酸的和起始靶序列反向互补的序列。

所得RNA分子会形成分子内茎环结构,随后在Dicer酶的作用下形成siRNA双链。

我们可提供pENTR™/U6(货号K492000)和pENTR™/H1/TO(货号K494500)载体用于shRNA传递。两种载体都是Gateway®兼容的,分别利用U6或H1/TO启动子驱动shRNA表达。pENTR™/H1/TO载体可用于shRNA诱导型表达,而pENTR™/U6载体可用于组成型表达。如果您想设计可同时兼容这两种载体的shRNA寡核苷酸,应选择pENTER™/U6载体。请查看以下载体图谱:

BLOCK-iT™诱导型H1和U6入门载体试剂盒分别使用Pol III依赖的H1或U6启动子。经过修饰的H1启动子含有2个侧翼四环素操纵子(TetO2)位点。因此,在表达四环素阻遏蛋白(TR)的细胞中,可对从该启动子开始表达的shRNA进行调控。H1和U6都是Pol III型启动子;但是,所使用的细胞系不同,它们的有效性可能存在轻微差异。

TO代表四环素操纵子,因为该入门载体含有shRNA在哺乳细胞中发生四环素诱导型表达所需的元件。四环素操纵子序列使目标shRNA能够以四环素依赖性方式进行表达,因此,这是一个诱导型系统。

您将需要双链寡核苷酸,用于编码待克隆入上述任一载体的目标shRNA。使用我们的 RNAi Designer ,设计和合成2个互补的单链DNA寡核苷酸,其中一个用于编码目标shRNA。

您将需要退火等量的上游链和下游链寡核苷酸,从而生成双链寡核苷酸。如果您的单链寡核苷酸是冻干形式的,可在使用前用水或TE缓冲液将其重悬至终浓度200 µM。我们通常在单链寡核苷酸终浓度为50 μM时进行退火。在浓度低于50 μM时退火,会显著降低效率。请注意,退火步骤效率不是100%的,即使在浓度为50 μM时,也会有约一半的单链寡核苷酸仍未退火。请参见以下步骤:

1. 使用0.5 mL无菌微量离心管,在室温下设置以下退火反应:

         试剂                                                      用量

       “上游链”DNA寡核苷酸(200 μM)                    5 μL

        “下游链”DNA寡核苷酸(200 μM)               5 μL

         10X寡核苷酸退火缓冲液                            2 μL

         无DNase/RNase水                             8 µL

         总体积                                                 20 μL

2. 如果对lacZ双链对照寡核苷酸进行退火,则将离心管短暂离心(约5秒),然后将离心管的内容物转移至一个单独的0.5 mL无菌微量离心管中。

3. 在95°C孵育反应4分钟。

4. 将含有退火反应的离心管从水浴或加热模块中取出,放置在实验桌上。

5. 放置5-10分钟,等待反应混合物冷却到室温。在这段时间内,单链寡核苷酸会退火。

6. 将样品置于一个微量离心机中并短暂离心(约5秒)。轻轻混合。

7. 取出1 μL退火混合物,按照说明稀释双链寡核苷酸。

8. 将剩余的50 μM双链寡核苷酸混合物保存于-20°C。

如有需要,您可通过琼脂糖凝胶电泳来验证退火双链寡核苷酸的完整性。

我们建议您另取一份分装的的退火双链寡核苷酸(5 μL的500 nM储液)进行电泳,并与等体积的各起始单链寡核苷酸(将200 μM储液稀释400倍至500 nM;取5μL稀释液进行凝胶电泳分析)进行对比。应确保使用合适的分子量标准品。我们通常使用以下凝胶和分子量标准品:

  • 琼脂糖凝胶:4% E-Gel®(货号G5000-04)
  • 分子量标准品:10 bp DNA Ladder(货号10821-015)

当使用琼脂糖凝胶电泳对退火双链寡核苷酸反应的小样进行分析时,我们通常可以看到以下结果:

  • 一条可检测到的高分子量条带代表退火的双链寡核苷酸。
  • 一条可检测到的低分子量条带代表未退火的单链寡核苷酸。应注意,这个条带应该是能检测到的因为仍有大量的单链寡核苷酸未退火。

下图为预期结果实例:

为得到最佳结果,连接时双链寡核苷酸片段与载体的摩尔比应为10:1。

请遵循以下步骤:

  • 访问 RNAi Designer
  • 输入检索号或提供核苷酸序列
  • 确定设计的靶标区域:ORF、5’ UTR或3’ UTR
  • 选择Blast数据库
  • 选择最小和最大G/C比例

选择载体和链方向,点击“RNAi Design”开始设计shRNA。

shRNA的转录从U6启动子序列末端后面的第一个碱基开始。在上游链寡核苷酸中,转录起始位点相当于4 碱基 CACC序列后的第一个核苷酸,加入4 碱基 CACC序列是为了实现定向克隆。我们建议以鸟嘌呤核苷酸(G)作为shRNA序列的起始,因为天然U6snRNA的转录是以G开始的。请注意下列情况:

  • 如果G是目标序列的一部分,则将G并入上游链寡核苷酸的茎序列,并在上游链寡核苷酸的3’端加一个互补C。
  • 如果G不是目标序列的第一个碱基,我们建议直接在上游链寡核苷酸5’末端紧随CACC突出序列后加一个G。这种情况下,不要在上游链寡核苷酸的3’末端添加互补C。注意:我们已经发现,在这种情下添加互补C,可导致shRNA活性降低。或者,如果没有特别想以G作为转录起始,则应使用腺嘌呤核苷酸(A),而不要使用C或T。但是,应注意的是,除了G以外,使用其它任何一种核苷酸都会影响起始效率和位置。

您可使用长度在4-11个核苷酸范围内的任何环序列,但是,通常优先选择较短的环(即,4-7个核苷酸)。应避免使用含有胸腺嘧啶核苷酸(T)的环序列,否则有可能会导致过早转录终止,特别是在目标序列本身以1个或多个T核苷酸终止的情况下。以下是一些我们推荐使用的环序列:

  • 5’ – CGAA – 3’
  • 5’ – AACG – 3’
  • 5’ – GAGA – 3’

很遗憾,pENTR/U6载体不含筛选标记;因此,只能实现瞬时RNAi分析。如果您想建立稳定细胞系,可通过LR反应将shRNA克隆进入合适的Gateway®目的载体中,生成表达克隆。

pENTR™/H1/TO载体含有Zeocin™抗性基因,方便制作能够诱导表达目的shRNA的细胞系。可通过做一个杀死曲线,确定杀死未转染哺乳细胞所需的Zeocin™最低浓度。请注意,Zeocin™敏感性细胞不会聚集和脱离培养皿,但可能会出现体积增大、细胞形态异常、细胞质中形成较大的空泡或细胞膜/和膜分解。

是的,使用我们的pENTR™/H1/TO载体构建的重组质粒,是能够通过四环素调控shRNA表达的,它是基于抑制/去抑制机理。四环素阻遏蛋白(TR)在宿主细胞中的表达量将决定对pENTR™/H1/TO重组质粒中四环素操纵子序列的转录抑制水平。该系统的四环素调控机理是基于四环素与四环素阻遏蛋白的结合,解除了对控制目标shRNA表达的启动子的抑制作用。在该系统中,缺乏四环素可抑制目标shRNA的表达,存在四环素可诱导目标shRNA的表达。在BLOCK-iT™诱导型H1 RNAi入门载体系统中,重组质粒pENTR™/H1/TO上的目的shRNA的表达受到人类H1启动子的控制,而这个H1启动子整合了2个拷贝含19个核苷酸的四环素操纵子序列(TetO2)(即,H1/TO启动子)。每个含19个核苷酸的TetO2序列可被2个四环素阻遏蛋白结合。

在无四环素的情况下,四环素阻遏蛋白(根据需要,由pcDNA™6/TR质粒或pLenti6/TR慢病毒质粒表达)形成一个同源二聚体,该同源二聚体以极高的亲和力结合到pENTR™/H1/TO的H1/TO启动子的每个TetO2序列上(Hillen和Berens,1994)。H1/TO启动子的2个TetO2位点可作为4分子(或2个同源二聚体)四环素阻遏蛋白的结合位点(见下页中的图)。四环素阻遏蛋白同源二聚体与Tet O2序列的结合,可抑制目标shRNA的转录。在加入四环素的情况下,四环素与四环素阻遏蛋白同源二聚体以1:1 的化学计量比高度结合,使阻遏蛋白发生构象改变而不能与四环素操纵子结合。四环素阻遏蛋白-四环素复合物随后与四环素操纵子分离,从而诱导目标shRNA转录,实现目标基因敲低。

注意:四环素阻遏蛋白与四环素操纵子的亲和力KB = 2 x 1011 M–1(在生理学条件下测量),其中,KB为结合常数(Hillen和Berens,1994)。四环素与四环素阻遏蛋白的结合常数KA = 3 x 109 M-1(Takahashi等,1991)。

我们不提供抗TR抗体。虽然使用抗TR抗体进行免疫印迹分析可以筛选出不表达任何TR蛋白的克隆,但这不是筛选功能性克隆的最佳方式。对于该目的的功能测试,我们建议使用lacZ表达对照质粒进行瞬时转染,随后选出在无四环素时β-半乳糖苷酶基础表达水平最低并且在加入四环素时β-半乳糖苷酶基础表达水平最高的克隆。

多西环素可作为BLOCK-iT™ Inducible H1 RNAi系统的替代诱导剂。其作用机理与四环素相似,T-REx™系统与四环素具有相似的剂量效应和诱导特点。多西环素已被证明比四环素具有更长的半衰期(分别为48小时和24小时)。我们不提供多西环素,但您可从Sigma公司购买(货号D9891)。

在建立稳定细胞系时,量效曲线或杀伤曲线是一种用于确定最佳抗生素使用浓度的简单方法。为确定杀死全部未转染细胞所需的最低抗生素用量,可将未转染细胞置于含有不同浓度抗生素的培养基中生长。做量效曲线或杀伤曲线的基本步骤如下:

  • 以汇合度25%的细胞密度将未转染细胞接种到培养皿中,并加入含递增浓度抗生素的培养基使细胞生长。对于某些抗生素,您将需要计算活性药物量以控制批次间差异。
  • 每3-4天补充选择培养基。10-12天后,检测培养皿中的活细胞数。在出现细胞死亡前,细胞可能在选择培养基中分裂过1-2次。
  • 找到杀死全部细胞所需的最低抗生素浓度,即用于建立稳定细胞系所需的最佳抗生素浓度。

请遵循使用手册第52页的说明。

不能,您使用的入门载体应含有可使shRNA发生RNA聚合酶III依赖性表达所需的元件(即,Pol III启动子和终止子)。

请访问我们的转染支持中心,查找关于转染的技术资源、贴士和技巧以及问题排查信息。

miRNA RNAi载体

microRNAs(miRNAs)是内源性表达的单链小RNA序列,长度约为22个核苷酸,可通过与RNAi通路共享元件而自然地指导基因沉默(Bartel,2004)。但是,与shRNA不同,miRNA被发现嵌入在(有时成簇嵌入)长约几千碱基的含发夹结构的长初级转录本(pri-miRNA)中,并受到RNA聚合酶II(Lee et al,2004)的驱动,该聚合酶也负责mRNA的表达。Drosha酶是一种细胞核RNase III,可剪切pri-miRNA的茎环结构,生成小发夹前导miRNA(pre-miRNA),长度约为70个核苷酸(Zeng等,2005)。输出蛋白-5(exportin-5),一种细胞核转运蛋白,可将pre-miRNA从细胞核转运到细胞质(Bohnsack et al,2004;Yi et al,2003)。经过出核转运后,Dicer酶将pre-miRNA剪切成约为22个核苷酸的miRNA(成熟miRNA)分子,并整合进入含miRNA的RNA诱导的沉默复合物(miRISC)(Cullen,2004)。

请参见以下RNAi载体技术对比表:

BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi

BLOCK-iT™ shRNA

Pol III表达系统

Pol III表达系统

miRNA的多顺反子表达(串联)

每个启动子的单个shRNA表达

GFP共表达可对表达进行追踪

只能追踪导入效果(使用单独的表达盒)

兼容大部分Gateway® DEST载体

兼容BLOCK-iT™ DEST载体

设计成功率最高(>70%)

设计成功率中等(约50%)

该载体可用于稳定表达并且能够使用病毒导入。该miR RNAi载体包括内源性 miRNA 的侧翼序列和茎环序列,可指导从较长的Pol lI转录本(pri-miRNA)上切除改造过的miRNA。当存在细胞核时,这些载体可有效使用内源性细胞器加工生成具有敲低作用的序列,这些经过特殊设计的序列与您的目标序列具有100%同源性,可引起靶标切割。此外,茎环序列具有特殊的限制性酶切位点,因此,它能够实现线性化而获得更有效的测序,这对具有发夹结构的标准的shRNA有时是一个挑战。使用该试剂盒可获得超过70%的敲低成功率,轻松追踪表达(可共同表达绿色荧光蛋白),实现同时敲低多个靶标以及组成型或诱导型表达。

载体经过设计和优化可用于表达经修饰的miR155结构,并最终生成通过RNAi通路实现基因打靶的siRNA。如果想用来表达天然miRNA,可能还需更多优化。或者,也可将天然miRNA克隆进入标准蛋白表达载体,并检查是否有miRNA产物。请查看我们针对miRNA过表达给出的2个建议:

1. 对gDNA进行PCR,扩增内源性pre-miRNA发夹以及两侧约为50–80 bp的侧翼序列,然后TOPO克隆进入表达载体,例如我们的pcDNA载体。这将会产生一个包含天然侧翼序列和pre-miRNA的转录本。这将可能成为最佳的内源性miRNA类似物,因为侧翼序列和前导miRNA含有正确的加工生成成熟miRNA所需的信息。该技术的缺点在于有点费时费力并且不适合用于分析多种miRNA(每个都需要识别基因位点、引物设计和成功的PCR)。

2. 在Invitrogen BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi载体系统中,使用成熟miRNA序列(或它的前21个核苷酸)作为“反义”序列。该技术已成功发表(见Lee et al,PNAS 2006;103;15669-15674),可实现快速、简单的设计和克隆。

该方法能够以相同的方式建立许多miRNA载体。我们也非常明确miR RNAi载体的主要产物具有预期的成熟miRNA 5’末端。但是,我们也知道3’末端是可变的,可能会包括一些包含茎环序列核苷酸(GUU……)的稍小或稍长的种类。3’末端可能对miRNA功能来说最不重要,但是对于某些miR-target相互作用可能较为重要,只是我们并不知道这些类似物与内源性miRNA有多接近。

 

 

 

 

推荐使用我们的pcDNA6.2™GW/EmGFP-miR载体,其中,EmGFP与目标miRNA共同表达。您将看到EmGFP表达与miRNA的敲低活性呈100%相关性。请查看以下实例:

在该实例中,使用Lipofectamine® 2000试剂对细胞进行转染并得到预期的50%转染效率,然后对EmGFP和miRNA表达实现了100%追踪。48小时后,使用Hoechst细胞核染料(可对所有细胞染色)和红色lamin蛋白染料对细胞进行染色,并检测GFP表达。近一半的细胞高度表达lamin蛋白。将表达EmGFP的细胞照片与经lamin A/C染色的细胞照片重叠时,可明显看出表达GFP的细胞不存在lamin A/C,而有红色lamin A/C染色的细胞无任何GFP表达。这说明,由于表达EmGFP的细胞中存在共表达的miRNA,其lamin表达大幅减少。

 

根据已发表的文献(Tsien,1998),pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR表达载体中EmGFP的激发和发射波长分别为487 nm和509 nm。可使用标准FITC滤波装置进行检测。我们推荐使用Omega XF100。

miRNA有时会在RNA Pol II(Lee et al,2004)的驱动下,在长初级转录本中成簇表达。我们的载体支持miRNA串联,使它们可以在一个初级转录本中表达,从而确保多个miRNA的共表达。在最后的重组质粒中,原来的限制性酶切位点会重新出现,使重组质粒能够进行多次串联。下图揭示了将2个来自不同miRNA载体的miRNA串联进入1个miRNA表达载体的原理。注意:将靶向不同基因的miRNA串联在一起,通常会稍微削弱其对各自基因的敲低作用。将靶向相同基因的不同miRNA或者相同的miRNA串联在一起,会增强敲低作用。由于miRNA串联增加了转录本的加工过程,因此,EmGFP的表达会被削弱。

见使用手册第33页对如何串联pre-miRNA的说明

 

我们认为这个G是必不可少的,因为它是成熟miRNA序列之前的“侧翼”区域中最后一对碱基对(来自鼠miR-155)的一部分。成熟miRNA序列将成为RNAi的引导链。

请参见以下关于Gateway®目的载体兼容性的表格:

目的载体或系统

兼容性

货号

ViraPower™慢病毒载体,包括多位点Gateway®

兼容pLenti6/V5-DEST™和pLenti6/UbC/V5-DEST™

V49610、V49910和K493400

EF-1a启动子(pEF-DEST51)

兼容

12285011

T-REx™ (pT-REx™-DEST30)

兼容

12301016

Flp-In™ (pEF5/FRT/V5-DEST™)

兼容

V602020

N端报告标签(GeneBLAzer™, YFP, Lumio™)

兼容pcDNA™6.2/N-YFP/DEST

V358-20

多位点Gateway®(pDEST/R4-R3)

兼容TK polyA 3’端元件和多种5’端启动子元件

12537023

请注意,将pre-miRNA表达框从pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR转移到pLenti6/BLOCK-iT™-DEST载体,不会产生功能性miRNA表达载体。pre-miRNA的表达需要目的载体提供Pol II启动子。

请访问我们的 BLOCK-iT® RNAi Designer 并选择miR RNAi作为您的靶标设计选项。该miR RNAi随后可被克隆进入pcDNA™6.2-GW/miR和pcDNA™6.2/EmGFP-miR载体。

为建立乱序miR RNAi阴性对照,我们建议在引导链RNA的两端都保留相同的2-3个核苷酸并打乱中间部分,然后通过BLAST找到明显的问题。要建立点突变miR RNA阴性对照,单个碱基改变可能不够,但是如果要这么做的话,最好的突变位置是反义序列的第10或11个核苷酸。

pcDNA™6.2-GW/+EmGFP-miR表达载体包含杀稻瘟菌素抗性基因,可对稳定转染pcDNA™6.2-GW/+EmGFP-miR重组质粒的哺乳细胞进行杀稻瘟菌素筛选。首先对未转染的哺乳细胞做一个杀伤曲线,然后将您的表达克隆转染进入选定的哺乳细胞系中,使用杀稻瘟菌素选出稳定表达的细胞系。

通过对载体进行DraI消化和自身环化,形成可表达相同pre-miRNA 的pcDNA™6.2-GW/miR克隆。更多详细方案,请参见使用手册第40页。

基于病毒的RNAi表达系统

腺病毒是DNA病毒,可瞬时转导几乎所有类型的哺乳细胞。腺病毒通过结合到柯萨奇-腺病毒受体(CAR)而进入靶细胞。腺病毒结合到CAR后,通过整合素介导的内吞作用而进入细胞,随后通过主动运输到达细胞核并在此以游离体形式表达其DNA。

致癌逆转录病毒和慢病毒是正链RNA病毒,它们可将其基因组稳定整合到宿主细胞的染色体中。当使用具有广泛趋向性的包膜(如水泡性口炎病毒包膜糖蛋白(VSV-G))进行伪装时,这些病毒可进入几乎所有类型的哺乳细胞。但是,致癌逆转录病毒转导细胞依赖于细胞分裂时核膜的分解。相反,慢病毒采用主动入核转运途径转导至非分裂细胞,从而成为一种更为通用的工具。

腺病毒系统

慢病毒系统

有效转导至分裂和非分裂细胞

有效转导至分裂和非分裂细胞

用于研究基因敲低,具有高水平瞬时表达

用于研究长期基因敲低,能够稳定表达

转导细胞群具有可靠性和重现性

转导细胞群具有重现性

诱导型或组成型基因敲低

诱导型或组成型基因敲低

应注意,两种系统的基因表达通常都可在转导后24-48小时内被检测到,因此,这两种系统都可用于瞬时性实验。主要区别在于,慢病毒可整合到宿主基因组中,而腺病毒不能。使用腺病毒可获得较高的病毒滴度。慢病毒导入系统具有shRNA和miR RNAi两种载体,而腺病毒导入系统只有shRNA载体。

请参见以下步骤:

  1. 将编码shRNA或miR RNAi的双链DNA寡核苷酸克隆进入一种BLOCK-iT™入门(shRNA)或表达(miR RNAi)载体中。
  2. 通过Gateway®重组反应将RNAi表达盒转移到腺病毒(仅shRNA)或慢病毒目的载体。
  3. 将RNAi载体转染到病毒生产细胞中,获得病毒储液,该储液可立即使用或保存于–80°C。
  4. 收集病毒上清液并测定滴度(根据需要对腺病毒储液进行扩增)。
  5. 将慢病毒或腺病毒储液转导至任意细胞类型。

请参见以下定义:

  • 感染:适用于发生病毒复制并生成传染性子代病毒的情况。只有稳定表达E1的细胞系能够被感染。
  • 转导:适用于无病毒复制且不生成传染性子代病毒的情况。不表达E1的哺乳细胞可被转导。在这种情况下,您可使用腺病毒作为shRNA的传递载体。

腺病毒不是一种活跃的裂解病毒,一般成熟病毒颗粒经过2-3天可在细胞中积累。随着细胞内病毒的积累和绝对数量增加,生产细胞发生聚合并最终破裂。一旦发生这种情况,邻近细胞也会被感染,并开始重复为期3天的循环。“细胞病变效应”或CPE,可用于描述上述情况,该效应通常出现在感染后7天内,表现为经过2个周期感染、复制和细胞破裂形成的“彗星状”空斑。

  • 感染7天后,CPE会扩大;感染后约10天,CPE将最终遍及整个培养皿。
  • 培养皿中的细胞被感染后,需要约10天的时间才能收获病毒(如上所述)。
  • 一旦获得原代病毒储液,即可使用感染复数(MOI)为3的病毒储液感染新鲜的293A细胞而直接进行扩增。

强烈建议将刚生成的慢病毒或腺病毒储液立即分装并保存于-80°C。与腺病毒相比,慢病毒对冻融处理更敏感。腺病毒储液通常可反复冻融最多3次而无滴度损失,而慢病毒储液每次冻融都会损失多达5%或更多的滴度。若适当保存,病毒储液可使用长达一年。长期保存后,请在使用前重新对病毒储液进行滴度测定。

BLOCK-iT™ RNAi慢病毒系统

慢病毒是一种发病缓慢的逆转录病毒,其特征为潜伏期较长。

我们的慢病毒载体是以HIV-1骨架为基础。但是,这些慢病毒载体经过多种改造后,只能发挥基因传递载体的作用,而不会引发病毒复制或疾病。为提高安全性,已删除了特异性HIV-1基因。HIV-1基因只能在生产细胞(293FT)中表达,而不会被包装进入病毒基因组,因此,转导靶细胞不会表达HIV-1基因。

我们建议将慢病毒表达载体保存在-20°C。由于这类载体相对较大,我们不建议将其保存在-80°C,否则载体溶液会完全冻结。从-80°C冻融多次会影响克隆效率。

使用BLOCK-iT™慢病毒RNAi表达系统行使使用慢病毒导入shRNA至哺乳细胞,可带来以下优势:

  • pENTR™/U6入门载体可快速、有效地将编码所需shRNA目标序列的双链寡核苷酸克隆到含RNA Pol III依赖性表达盒(即,U6 RNAi表达盒)的载体中,用于RNAi分析。
  • 该系统中的载体是Gateway®兼容的,可轻松将pENTR™/U6载体的U6 RNAi表达盒重组到pLenti6/BLOCK-iT™-DEST载体中。
  • 生成的复制缺陷型慢病毒可有效转导至分裂和非分裂哺乳细胞,从而拓宽该系统的RNAi应用潜能,超越了其他传统逆转录病毒系统的应用范围(Naldini,1998)。
  • 可将目标shRNA高效导入至培养的或体内的哺乳细胞中。
  • 目标shRNA的表达比传统腺病毒系统更稳定、更长久。
  • 产生的假病毒适用的宿主范围更广(Yee,1999)。
  • 具有多种可增强生物安全性的设计特点。

我们不建议将小量提取的质粒DNA用于慢病毒生产。我们建议使用S.N.A.P.™中量提取试剂盒(货号K1910-01)或PureLink® HiPure质粒中量提取试剂盒(货号K210004),它们的重悬缓冲液含有10 mM EDTA。由于慢病毒DNA中量制备也会经常得到较低的DNA得率,我们建议遵循特定的实验方案以提高得率——简单来说,应该使细胞缓慢生长、每个纯化柱上使用较少的细胞并且每次DNA中量提取应使用100 mL慢病毒培养液。

可以,慢病毒表达载体本身也可作为表达载体,可使用合适的抗生素进行稳定筛选。请注意,该载体的体积是大部分普通载体的2倍左右。因此,您可能需要增加载体的转染用量,使其接近普通载体的摩尔量。

这两种启动子在HEK 293细胞中的组成型敲低能力基本相同。有报道显示,在其他细胞类型中,H1或U6将有一个更活跃,但是它们之间的差异通常非常小。

包装混合物含有经过优化的3种包装质粒的混合物:pLP1、pLP2和pLP/VSVG。这些质粒为生产慢病毒提供辅助性功能以及结构和复制反式蛋白。很遗憾,我们不单独销售包装质粒;但是,您可单独购买ViraPower™包装混合物(货号K497500)。

BLOCK-iT™慢病毒RNAi表达系统中的慢病毒和包装载体于1998年由Dull等人开发,它们是以慢病毒载体为基础的第三代载体。第三代慢病毒系统带有许多安全特性,可提高生物安全性,并将该系统与野生型人类HIV-1病毒的关联性降至最低。BLOCK-iT™慢病毒RNAi表达系统的主要安全特性如下:

  • pLenti6/BLOCK-iT™-DEST表达载体删除了3’ LTR(ΔU3),这不会影响生产细胞中病毒基因组的生成,但会导致慢病毒在转导至靶细胞后发生“自我失活”(Yee et al.,1987;Yu et al,1986;Zufferey et al,1998)。一旦整合到转导的靶细胞中,慢病毒基因组将不能再生产可包装的病毒基因组。
  • 用于该系统的HIV-1基因已被减少至3个(即,gag、pol和rev)。
  • 水泡性口炎病毒的VSV-G基因被用于代替HIV-1的包膜(Burns et al,1993;Emi et al,1991;Yee et al,1994)。
  • 编码结构和病毒基因组包装元件的基因被分散在4个质粒上。这4个质粒经过加工改造,彼此之间不含有任何同源性区域,可防止发生不必要的重组事件而生成可复制病毒(Dull et al,1998)。
  • 虽然3个包装质粒均可实现在293FT生产细胞中生产子代病毒(如gal、pol、rev、env)所需的反式蛋白表达,但它们3个都不含有LTRs或Ψ包装序列。这表示,包装病毒基因组中实际上不含任何HIV-1结构基因,因此,转导的靶细胞中也永远不会表达这些基因。不会产生新的可复制病毒。
  • 该系统生产的慢病毒颗粒是复制缺陷型病毒,只负责携带目的基因。不会产生其他病毒种类。
  • pLP1的gag和pol基因表达具有Rev依赖性,因为gag/pol mRNA转录本中含有HIV-1 RRE。在无Rev的情况下,加入RRE可阻止gag和pol的表达(Dull et al,1998)。
  • 在pLenti6/BLOCK-iT™-DEST表达载体的5’ LTR上游已加入了一个组成型启动子(RSV启动子),从而抵消有效生成病毒RNA时对Tat的需求(Dull et al,1998)。

 

尽管前文讨论了许多安全特性内容,但是该系统生产的慢病毒仍具有一些生物危害风险,因为它能够转导至原代人细胞。因此,我们强烈建议您将该系统生成的慢病毒储液作为生物安全2级(BL-2)生物体进行处理,严格遵守所有已发布的BL-2指南并采取适当的废物处理措施。此外,在建立携带潜在有害或有毒基因的慢病毒(如活化的致癌基因)时,应格外小心。关于BL-2指南和慢病毒处理的更多信息,请参考由疾病控制和预防中心(CDC)发布的第五版《微生物和生物医学实验室的生物安全性》。点击 这里,可下载该文档。

 

我们的慢病毒表达载体包含约20%的原始病毒基因组。出于安全性考虑,其余病毒基因组已从我们的慢病毒表达载体中删除。

我们的慢病毒表达载体属于第三代,也就是说,我们使用含4个质粒载体的系统(1个慢病毒表达载体和3个包装质粒),因此,无须担心各个元件会重组到一个载体上并产生可复制的慢病毒。此外,这些载体含有一个嵌合5’ LTR,使病毒生产不依赖于HIV tat反式激活因子。同时,LTR(长末端重复序列)的原始U3区域已被删除,从而使病毒发生自我失活,从而不能复制。

我们的慢病毒包装混合物属于第三代,这表示它不会表达tat基因。此外,gag/pol和rev基因被作为独立质粒提供,因此,无须担心各个元件会重组到一个载体上并产生可复制的慢病毒

我们的慢病毒表达载体属于第三代,这表示它们含有一个嵌合5’ LTR,使病毒生产不依赖于HIV tat反式激活因子。因此,它们能兼容第二代和第三代包装混合物。

您的第二代慢病毒载体不能兼容我们的包装混合物,因为我们的包装混合物属于第三代,不能表达tat基因,而您的慢病毒载体需要tat基因才能进行病毒生产。

我们的慢病毒包装混合物属于第三代,这表示它不会表达tat基因。它可与第三代或更新的慢病毒载体一起使用,这些载体中的病毒生产不依赖于tat基因。

为获得最佳结果,应使用Stbl3™ E. coli进行转化,因为该菌株特别适用于克隆不稳定的DNA,如含正向重复序列的慢病毒DNA。如有需要,你可将LR重组反应转到其他recAendAE. coli菌株中,包括TOP10和DH5α™。但是,应注意这些菌株不适用于克隆不稳定DNA,并且在仅含氨苄青霉素的培养皿中进行筛选时,可能存在少量(<5%)包含有害重组体的转化株(即,在5’和3’ LTR之间出现重组的质粒)。同时使用氨苄青霉素(100 μg/mL)和杀稻瘟菌素(50 μg/mL)进行筛选时,这类事件的发生率较低。还应注意,转化的E. coli在含氨苄青霉素和杀稻瘟菌素的LB培养基中生长更缓慢,可能需要稍微延长孵育时间以获得可见的菌落。

“F”代表快速生长的意思(称为293F),“T”代表SV40大T抗原。大T抗原表达质粒被稳定整合到细胞基因组中,使这些细胞对Geneticin®抗生素产生抗性。SV40大T抗原的存在对于生产高滴度慢病毒来说很重要,其机制尚不清楚。如果使用普通293细胞或其他293T细胞作为生产细胞,则会生产出滴度较低的病毒。注意,由于293FT细胞可稳定表达SV40大T抗原,我不建议使用含SV40复制起点的质粒构建稳定细胞系。

我们使用经过支原体检测的Gibco® FBS(货号16000-044)和以下塑料制品培养293FT细胞:我们发现,按照使用手册的说明使用该FBS培养293FT细胞时,比使用许多其他血清获得的病毒生产结果更好。

  • T175——Fisher货号10-126-13;这是一种带有0.2 μm透气密封盖的Falcon培养瓶。
  • T75——Fisher货号07-200-68;这是一种带有0.2 μm透气密封盖的Costar培养瓶。
  • 100 mm培养皿——Fisher货号08-772E;这是一种Falcon组织培养用聚苯乙烯培养皿。

在正常细胞培养/维持条件下,这种培养皿对细胞具有极佳的贴壁效果。

293FT细胞可稳定表达pCMVSPORT6Tag.neo质粒的SV40大T抗原,该质粒含有新霉素抗性标记。为了保留质粒/表型,细胞常规培养所用的培养基应含有浓度为500 μg/mL的Geneticin®(G418)抗生素。

在病毒生产期间,应观察到以下情况:

  • 293FT发生形态改变
  • 它们变成多核的(多核体)
  • 它们开始变得像气球或者好像快要爆炸
  • 它们经常脱离培养皿表面,但并不总是这样
  • 未转染的293FT细胞为转染细胞留下空间,在培养瓶的其他位置堆积起来

下图展示了293FT细胞转染前、转染后6小时、转染后24小时和转染后48小时的形态。

 

 

 

 

我们建议将生产得到的慢病毒储液立即分装成较小的工作体积,可长期保存在-80°C。慢病毒对保存温度和冻融处理很敏感,应谨慎处理。慢病毒储液每次冻融都会损失多达5%或更多的滴度。当适当保存时,病毒储液可使用长达一年。长期保存后,请在使用前重新对病毒储液进行滴度测定。

使用我们的系统生产的慢病毒是不可复制的,这是一种安全特性。每次需要更多病毒时,您都必须重新转染。

慢病毒表达系统——病毒滴度测定

我们强烈建议您进行病毒滴定,这将有助于:

  • 获得对指定细胞的最佳转导率
  • 控制慢病毒的整合拷贝数
  • 生成可重复的表达结果

我们强烈推荐使用人纤维肉瘤细胞HT1080(ATCC,货号CCL-121)作为慢病毒滴度测定的“金标准”。主要原因是这种细胞的转导效率较高,滴度测定结果准确、可重复。但是,您也可使用在表达研究中所用的相同哺乳细胞测定慢病毒储液的滴度。一般来说,应选用具有贴壁并且不迁移的细胞株,同时应具有范围为18-25小时的倍增时间。慢病毒滴度测定也可使用普通293细胞,但是我们不建议使用293T或293FT细胞,因为它们含有SV40大T抗原,这会导致在整合慢病毒表达载体的SV40复制起点处发生不必要的DNA复制。这经常会引起细胞死亡并获得很低的滴度。

  • 使用低传代次数(<20)的293FT细胞。使用含G418(500 µg/mL)的全DMEM对细胞进行传代。在培养基中补充非必须氨基酸和丙酮酸钠。每个100 mm培养皿中接种5 x 106个细胞。当接种用于第二天转染的细胞时,不要在培养基中加入任何抗生素。
  • 同时使用Lipofectamine® 2000试剂和您的质粒DNA时,应将它们轻轻混合——不要用移液器反复吹打。应确保所用的质粒DNA经过Invitrogen™ S.N.A.P.纯化柱(中量提取)或PureLink® maxi或mega大量提取试剂盒的分离并且足够干净以用于这些转染。不要使用小量提取的质粒DNA。

您可以使用p24 ELISA实验来检测慢病毒的滴度,但是应记住所测滴度不能用于衡量具有活性功能的病毒的数目,因为这种方法可同时检测非活性和活性病毒。因此,使用该方法得到的滴度,通常比检测活性病毒的方法(例如杀稻瘟菌素筛选)得到的滴度高10倍左右。

您可以使用PCR/qPCR分析来检测慢病毒的滴度,但是应记住所测滴度不能用于衡量具有活性功能的病毒的数目,因为这种方法可同时检测非活性和活性病毒。因此,使用该方法得到的滴度,通常比检测活性病毒的方法(例如杀稻瘟菌素筛选)得到的滴度高10倍左右。

可以,通过FACS分析GFP表达情况确定滴度。如果慢病毒载体不含GFP,则可使用抗生素筛选的病毒滴度实验方案。对于可表达lacZ的慢病毒,可根据lacZ的表达得到滴度的近似值(基于以不同滴度进行病毒转导后的lacZ表达情况),但这种滴度测定方法并不是非常准确。根据我们的经验,与基于GFP表达或Bsd筛选的测定方法相比,lacZ滴度测定法的准确性或重复性较低,因为该方法需要用眼睛对显微镜下的蓝色细胞进行观察和计数。

慢病毒表达系统——转导和分析

慢病毒包膜是由水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)伪装的,这使慢病毒能够与其靶细胞以非受体依赖性方式发生相互作用。因此,慢病毒具有广泛的趋向性,理论上可转导任何类型的哺乳细胞。

这种非受体依赖性的进入靶细胞方式可能与内吞作用有关(Espenshade et al. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:11694; Aiken (1997) J Virol 71:5871)。

我们已经发现,用MOI约为1的慢病毒转导分裂能力旺盛的细胞(如HT1080)时,通常有80–90%的细胞可表达目的基因。对于一些非分裂细胞转导慢病毒形式的表达质粒效率较低。例如,使用MOI约为1的慢病毒转导培养的原代人成纤维细胞时,只有约50%的细胞可表达目的基因。当您想转导慢病毒表达质粒至非分裂细胞时,为了使您的重组蛋白达到最佳表达水平,可能需要增加MOI值(如MOI = 10)。当您首次尝试将慢病毒表达质粒转导至哺乳细胞时,我们建议使用一系列MOI(例如,0、0.5、1、2、5和10),以确定获得最佳蛋白表达水平所需的MOI。

MOI表示感染复数。MOI是指感染病毒后每个细胞中的病毒颗粒数目,通常与整合事件的数量相关并最终影响基因的表达水平。一般来说,表达水平会随着MOI的增加而增加。

多种因素可影响最佳MOI的获得,包括:

  • 哺乳细胞的性质(即,非分裂和分裂细胞)
  • 哺乳细胞的转导效率
  • 目的基因的性质
  • 表达shRNA所用的实验方案

刚开始时,以MOI为10的Lenti6/TR表达质粒转导细胞,以MOI为1-5的Lenti4/BLOCK-iT™-DEST表达质粒转导细胞。您可通过改变Lenti6/TR和/或Lenti4/BLOCK-iT™-DEST慢病毒的MOI,对基础表达水平和四环素诱导的表达水平进行优化。

Lenti4/BLOCK-iT™-DEST construct into cells at an MOI of 1 to 5. You may optimize basal and tetracycline-induced expression levels by varying the MOI of the Lenti6/TR and/or Lenti4/BLOCK-iT™-DEST lentiviruses transduced.

Polybrene®试剂(海地美溴铵)是由Sigma-Aldrich(货号H9268)生产的一种阳离子聚合物,可通过中和病毒颗粒与细胞表面之间的静电排斥而提高转导效率。为得到最佳结果,我们建议使用Polybrene®试剂进行转导。但是,请注意,有些细胞(如,原代神经元)对Polybrene®试剂比较敏感。因此,在开始转导实验前,您可能需要检测细胞对浓度范围为0-10 μg/mL的Polybrene®试剂的敏感性。如果细胞表现出毒性反应或表型改变,则应避免使用Polybrene®试剂。

请尝试使用DEAE-dextran。以下文献使用了DEAE进行细胞转导:Reiser et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA, 93:15271。

可以,有多种方法可以浓缩VSV-G假型慢病毒,并且不会显著影响其转导能力。如果慢病毒储液的滴度相对较低(低于5 x 105 TU/mL),并且您的实验需要使用大体积的病毒上清液(如,相对较高的MOI),那么,您可能希望在开始转导前对病毒进行浓缩。请参考以下文献:Yee, J.K., The Development of Human Gene Therapy 1999, pp. 21–45,获取关于如何浓缩病毒的指南。

慢病毒整合到基因组是随机的。受到整合位点周围基因组序列的影响,您可能会观察到不同的杀稻瘟菌素和Zeocin™抗性克隆间目的基因敲低水平也是各不相同的。建议至少检测10个杀稻瘟菌素和Zeocin™抗性克隆,并选择本底表达水平最低且能诱导出最高目的基因敲低水平的克隆进行下一步研究。

使用pLenti4/BLOCK-iT™-DEST构建的重组慢病毒进行RNAi研究时,我们通常可在转导后48-120小时内观察到对基因表达的显著抑制。基因敲低的程度取决于检测时间、目标蛋白的稳定性以及其他因素。请注意,通常无法实现100%的基因敲低,但是,经过优化条件可能会达到80%以上。

是的,我们提供4种T-REx™细胞系:293、HeLa、CHO或Jurkat细胞。此外,您也可使用pcDNA™6/TR自行建立可稳定表达四环素阻遏蛋白的T-REx™细胞系。

Stbl3感受态细胞

Stbl3细胞来自HB101菌株。

对减少Stbl3细胞内的重组反应有帮助的特异性遗传标记还没有确认。

Stbl3通过测试并被特别推荐用于克隆含正向重复序列的不稳定慢病毒DNA序列,包括所有Invitrogen™ pLenti表达载体。尚未检测Stbl3对其他序列的稳定性,但是对于某些Stbl2或Stbl4细胞无效的情况可能有效。

在某些情况下,胞质中的核酸内切酶(核酸内切酶A)会与质粒DNA共同纯化,导致分离的DNA在下游应用中发生降解。核酸内切酶A非常稳定,煮沸也不一定能彻底去除。通常人们只有在较高温度下孵育质粒DNA后,才会发现核酸内切酶的存在,例如在限制酶切消化实验中。核酸内切酶在37°C会变得非常活跃,随后在凝胶上对消化的质粒进行分析时,只会出现一抹降解的DNA弥散条带。

建议采用以下步骤除去Stbl3质粒样品中的核酸内切酶:

  • 如果使用硅胶柱进行纯化,应执行实验操作中的“可选清洗”步骤。(例如:PureLink®快速质粒小量提取试剂盒中的清洗缓冲液W10,货号K2100-10)。对来自Stbl3细胞的质粒进行纯化时,该“可选”清洗步骤必不可少。
  • 使用阴离子交换柱(如PureLink® HiPure)进行大规模质粒提取时,通常在正常操作过程中即可将核酸内切酶从DNA中除去。
  • 如果采取自行制备溶液I、II和III的传统小量提取步骤,应确保溶液I含有EDTA。核酸内切酶的活性需要镁,而EDTA可除去Mg++。使用TE缓冲液重悬质粒DNA。
  • 在所有这些方法中,建议对纯化的DNA增加一个苯酚/氯仿提取步骤,从而确保除去纯化质粒中的核酸内切酶。

 

腺病毒表达系统

载体包含将重组子包装到病毒粒子中所需的元件(例如,5’和3’ ITR、包装信号、腺病毒晚期基因)。更确切地说,pAd/BLOCK-iT™-DEST载体包含:

  • 人类5型腺病毒序列(Ad 1-458和3513-35935),用于编码腺病毒正确包装和生产所需的基因和元件(如,左和右末端反向重复序列(ITR)、包装信号序列、晚期基因)(Hitt et al,1999;Russell,2000)
  • 2个重组位点,attR1和attR2,用于通过Gateway®技术对pENTR™/U6入门克隆的U6 RNAi表达盒进行重组克隆
  • 位于2个attR位点之间的氯霉素抗性基因(CmR),用于反向选择
  • 位于2个attR位点之间的ccdB基因,用于阴性选择
  • 氨苄青霉素抗性基因,用于在E. coli中进行筛选
  • pUC复制起点,用于在E. coli中高拷贝复制和维持质粒的稳定存在

腺病毒通过结合到柯萨奇/腺病毒受体(CAR)而进入靶细胞(Bergelson et al,1997)。腺病毒结合到CAR后,通过整合素介导的内吞作用而内在化(Russell,2000),随后通过主动运输到达细胞核。进入细胞核后,开始发生早期事件(如,E1蛋白的转录和翻译),随后发生腺病毒晚期基因的表达和病毒复制。请注意,晚期基因的表达依赖于E1。在BLOCK-iT™腺病毒RNAi表达系统中,293A生产细胞可提供E1。病毒生命周期约为3天。关于腺病毒生命周期和腺病毒生物学的更多信息,请参考已发表的综述(Russell,2000)。

人类5型腺病毒(Ad5)可通过结合到柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)而进入靶细胞,随后经过整合素介导而发生内在化。CAR/整合素蛋白普遍存在于哺乳细胞中,因此,腺病毒可转导的细胞类型非常广泛。如果您的特殊类型细胞具有非常低的CAR表达水平,则腺病毒转导效率很低,在这种情况下,您可能需要使用非常高的MOI(100s)以获得良好的表达。

BLOCK-iT™腺病毒RNAi表达系统具有以下生物安全特性:

pAd/BLOCK-iT™-DEST表达载体中的全部E1区域已被删除。其他病毒基因(如,晚期基因)的表达需要E1蛋白的表达,因此,病毒复制仅出现于表达E1的细胞中(Graham et al,1977;Kozarsky& Wilson,1993;Krougliak & Graham,1995)。该区域正是Gateway® Destination表达盒所在的位置。E3区域也已被删除。

  • 在所有不表达E1a和E1b蛋白的哺乳细胞中,pAd/BLOCK-iT™-DEST表达载体生产的腺病毒均不能复制(Graham et al,1977;Kozarsky& Wilson,1993;Krougliak & Graham,1995)。
  • 转导并不能将腺病毒整合到宿主基因组中。因为病毒是不能复制的,病毒基因组是瞬时存在的并最终会随细胞分裂而被稀释掉。

尽管前文讨论了许多安全特性内容,但是该系统生产的腺病毒仍具有一些生物危害风险,因为它能够转导至原代人细胞。因此,我们强烈建议您将该系统生成的腺病毒储液作为生物安全2级(BL-2)生物体进行处理,严格遵守所有已发布的BL-2指南。此外,当制备的腺病毒shRNA是靶向参与控制细胞分裂(如,肿瘤抑制基因)的人类基因时或大规模生产制备病毒时(见 使用手册第11页),应格外小心。

关于BL-2指南和腺病毒处理的更多信息,请参考由疾病控制和预防中心(CDC)发布的第四版《微生物和生物医学实验室的生物安全性》(http://www.cdc.gov/od/ohs/biosfty/bmbl4/bmbl4toc.htm)。

我们建议使用One Shot® ccdB Survival T1R化学感受态细胞(货号C751003)进行转化。该菌株可耐受ccdB的作用,可支持含ccdB基因的质粒扩增。为了维持载体的完整性,可使用含50-100 µg/mL氨苄青霉素和15-30 µg/mL氯霉素的培养基对转化子进行选择。

我们建议将腺病毒表达载体保存在-20°C。由于这类载体相对较大,我们不建议将其保存在-80°C,否则载体溶液会完全冻结。从-80°C冻融多次会影响克隆效率。

不需要,因为转移保留了表达盒的方向。但是,如果您想对DEST重组载体进行测序,我们推荐下列引物:

引物

序列

pAd正向引发位点

5′-GACTTTGACCGTTTACGTGGAGAC-3′

pAd反向引发位点

5′-CCTTAAGCCACGCCCACACATTTC-3′

 

我们使用经过支原体检测的Gibco® FBS(货号16000-044)和以下塑料制品培养293A细胞:

T175,Fisher货号10-126-13;这是一种带有0.2 μm透气密封盖的Falcon培养瓶。

T75,Fisher货号07-200-68;这是一种带有0.2 μm透气密封盖的Costar培养瓶。

100 mm培养皿,Fisher货号08-772E;这是一种Falcon组织培养用聚苯乙烯培养皿。

在正常细胞培养/维持条件下,这种培养皿对细胞具有极佳的贴壁效果(在制备腺病毒时,预期293A细胞发生细胞裂解)。

所有293衍生的细胞株或可表达E1蛋白的其他细胞,都可用于生产腺病毒。293A表示“贴壁”,因为293A细胞(只是常规293的一个单细胞克隆)易于贴壁,可在组织培养皿中平铺成良好的单层细胞。这就是它们特别适用于空斑试验的原因。常规293细胞不能形成相同类型的单层细胞;它们在生长时,细胞间会存在空洞和间隙。

约10%的转染细胞可生产病毒。感染的细胞会膨胀并释放病毒到周围细胞,使周围的细胞被杀死和膨起。观察单层区域由于细胞脱落和膨起而变透明的空斑。冲洗空斑/细胞体并收集。

在293A细胞中生产腺病毒储液时,我们通常采用以下经优化的转染指南。使用这些推荐指南所得到的腺病毒生产量约为10 mL病毒粗裂解物,滴度范围为1 x 107至1 x 108空斑形成单位(pfu)/mL。

  • 细胞:在6孔板的每孔中接种5 x 105个细胞(293A细胞应在转染前使用全培养基培养24小时,并在转染当天达到90-95%融合。应确保细胞在接种时处于健康状态)。
  • 转染混合物:将3 µL Lipofectamine® 2000与1 μg的PacI消化pAd-DEST表达质粒混合。注意:转染前,应验证PacI的线性化程度。SwaI应该也有效(如果插入片段中有一个PacI位点)。PacI只剪切34610和36684位点;Swal只剪切34616和36676位点。
  • 为优化转染,应尝试Lipofectamine® 2000与DNA的不同比例。
  • DNA浓度应至少为100 ng/µL或更高,其A260/A280比值(对于DNA大量提取和PacI消化后纯化的DNA)应在1.8-2之间。
  • 检测:将PacI剪切的对照DNA转染至2个孔中。转染后48小时,对其中一个孔染色以检测lacZ活性(结果应为50%蓝色或更好)。将另一个孔内的细胞转移到100 mm培养皿中,使细胞生长并形成空斑。
  • 通常可在10-14天左右检测到空斑(有时更快)。

在将表达克隆转染至293A细胞前,必须使病毒载体的左和右末端反向重复序列(ITR)暴露出来,有助于进行适当的病毒复制和包装。这样也会除去细菌序列(即,pUC复制起点和氨苄青霉素抗性基因)。

注意:应确保您的目标DNA序列不含有任何PacI限制性位点。如果您无法使用PacI位点,您可使用SwaI位点。

可以,293A细胞是易于转染的细胞,因此,两种试剂均可使用并可获得高效率。

滴度测定是在琼脂下生长的293A单层细胞上进行的,具体如下:

1. 感染前一天,在6孔板的每孔中接种1 x 106个细胞。

2. 感染当天,在每孔中加入1mL10倍连续稀释的病毒粗裂解物,范围在10–4至10–9之间。在37°C孵育过夜。

3. 第二天,弃去感染培养基,分别在每孔的细胞上轻轻覆盖2 mL琼脂覆层溶液。

4. 所有孔均被覆盖后,将6孔板在室温下的安全柜中平稳放置15分钟,直到琼脂覆层溶液凝固。

5. 将6孔板放在37°C的潮湿培养箱中。

6. 覆层后2天,在每孔中已有的琼脂覆层上补加1 mL琼脂覆层溶液。若补加延迟太久,可能导致培养基成分被细胞耗尽。

7. 感染后8天内可见空斑形成。当形成肉眼可见的空斑时(约转染后8天),使用细胞活性染料MTT对6孔板进行染色,方便空斑计数。

可使用10 mL移液管将细胞从孔板上吹打下来,从而收获含病毒的细胞。经过3次冻融(–80°C/37°C)使细胞内病毒释放,通过离心(使用台式离心机,以3,000 rpm离心15分钟)除去不溶物质,将病毒粗裂解物(CVL)上清液转移到新管子中并保存在–80°C。

可以,该方法可直接放大或缩小至任何尺寸的培养皿或滚瓶:

1. 使用MOI为3-5的病毒感染80–90%融合的293A细胞。

2. 感染后2-3天,当CPE达到80%以上时,冲洗并收集细胞,然后冻融3次以释放病毒。

下面这篇文献使用了氯化铯密度梯度离心法浓缩腺病毒,供您参考:

Engelhardt J F, Yang Y, Stratford-Perricaudet LD et al. (1993) Direct gene transfer of human CFTR into human bronchial epithelia of xenografts with E1-deleted adenoviruses. Nature Genetics 4:27–34.

为扩增腺病毒储液,我们通常使用100 µL粗制腺病毒储液在10 cm培养皿(每个培养皿对应一种重组腺病毒)中感染3 x 106个293A细胞。假设病毒滴度为1 x 107至1 x 108 pfu/mL,通常可在转染后2-3天收获所需数量的含腺病毒的细胞。

  • 可根据需要,改变感染细胞所用粗制病毒储液的体积。我们最多使用过1 mL的粗制病毒储液。
  • 如果粗制病毒储液的滴度是已知的,我们建议以MOI = 3-5来感染293A细胞。
  • 病毒扩增次数不要超过4次,因为这会增加生成有重组能力的腺病毒(RCA)的几率。应该先制备大体积的粗制病毒储液,然后根据需要分批次扩增一至二次。当您需要更多病毒时,应使用原始的粗制储液进行扩增。

我们建议将生产得到的腺病毒储液立即分装成较小的工作体积,可长期保存在-80°C。由于腺病毒无包膜,所以病毒储液相对稳定,对其进行一些冻融处理是可以接受的。我们建议病毒储液的冻融次数不要超过10次,否则会损失病毒滴度。当保存得当时,病毒储液可使用长达一年。长期保存后,请在使用前重新对病毒储液进行滴定。

粗制腺病毒的滴度通常为1 x 107至1 x 108空斑形成单位(pfu/mL)。您可使用该储液感染一批新的293A细胞,生成更高滴度的病毒储液(即,扩增病毒)。通过扩增可产生滴度范围为1 x 108至1 x 109 pfu/mL的病毒储液。有多种方法(如,氯化铯纯化法)可浓缩腺病毒,使其滴度高达1 x 1011 pfu/mL。

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