实验遇到问题了吗?

我们致力于确保您的成功,让您的实验重回正轨。敬请浏览我们针对常见问题情境提供的专业建议。

浏览下列相关问题答疑:

您正准备开始实验?敬请浏览我们的

入门页面

更多信息请浏览我们常见问题
解答数据库 ›

shRNA和miRNA RNAi载体

请查看以下可能原因:

  • 单链寡核苷酸的设计错误;应确认下游链寡核苷酸的序列与上游链寡核苷酸的序列是互补的。
  • 在寡核苷酸加热至95°C后,确保在室温下退火5-10分钟。
  • 应检查退火所用的上游链和下游链寡核苷酸的摩尔比,用量应相同。
  • 应确认下游寡核苷酸链的序列与上游寡核苷酸链的序列是互补的。
  • 使用shRNA载体时,应将互补序列的单链寡核苷酸混合。上游寡核苷酸链的5’末端应含有CACC,而下游寡核苷酸链的5’末端应含有AAAA。
  • 使用miRNA载体时,应确保上游寡核苷酸链的5’末端含有TGCT,而下游寡核苷酸链的5’末端含有CCTG

我们强烈建议对阳性转化子进行测序,确认双链寡核苷酸插入片段的序列。在筛选转化子时,我们发现多达20%的克隆可能包含突变的插入片段(通常在双链寡核苷酸中有1或2 bp缺失)。其原因尚不清楚,但可能是由于双链寡核苷酸插入片段中的反向重复序列触发了E. coli的修复机制引起的。注意:双链寡核苷酸插入片段有突变的入门克隆,在哺乳细胞中RNAi效果通常较差。应确认入门克隆具有正确的双链寡核苷酸序列,并将这种克隆用于您的RNAi分析。

使用劣质的单链寡核苷酸也会导致出现突变的插入片段。为避免出现这类问题,可使用质谱分析法来检验质量错误的峰,或订购HPLC或PAGE纯化的寡核苷酸。

难以测序可能是因为发夹序列是一种反向重复序列,在测序期间可形成二级结构,从而导致在测序进行到发夹区域时出现信号跌落。如果您遇到测序困难的情况,请尝试以下建议:

  • 使用高质量的纯化质粒DNA进行测序。我们建议使用Invitrogen™ PureLink® HQ小量质粒纯化试剂盒(货号K2100-01)或S.N.A.P.™质粒DNA中量提取试剂盒(货号K1910-01)来制备DNA。
  • 在测序反应中加入DMSO至终浓度为5%。
  • 增加反应中的模板用量(高达正常浓度的2倍)。
  • 标准测序试剂盒通常使用dITP代替dGTP,以减少G:Ccompression。其他含dGTP的试剂盒可用于对富含G和富含GT的模板进行测序。如果您在使用含有dITP的标准商业化测序试剂盒,再买一个含dGTP的测序试剂盒(如,dGTPBigDye® Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing试剂盒,货号4390229),并在测序反应中使用摩尔比为7:1的dITP:dGTP。

你可尝试减少转染试剂的用量,或使用其他转染试剂。此外,应确保使用的质粒是纯净的,并为转染实验准备的。

有多种因素可导致敲低效果较差。请参见以下建议:

  • 低转染效率:应确保转染所用培养基不含抗生素,并且细胞的汇合度合适;通过改变转染试剂用量而优化转染条件。
  • 做一个时间梯度检测,确定达到最高基因敲低水平的时间点。
  • 重组子中存在突变:对转化子中双链寡核苷酸插入片段进行测序验证。
  • 目标区域不是最佳的:选择一个不同的目标区域。
  • 应根据相应使用手册中的指南,设计siRNA。

请访问我们的转染支持中心,查找关于转染的技术资源、贴士和技巧以及问题排查信息。

诱导型RNAi表达

请确保您使用的含胎牛血清(FBS)的培养基已减少了四环素含量。许多FBS都含有四环素,因为FBS往往是从饮食中含四环素的牛体内分离出来的,这导致出现低水平的shRNA本底表达。应确保使用可表达Tet阻遏蛋白的细胞系,并以合适的MOI进行转导。如果您自行建立了可表达Tet阻遏蛋白的细胞系,则应在使用shRNA重组体转导细胞前至少等待24小时。

请查看以下可能原因:

  • 低转染效率——检查接种细胞的汇合程度、质粒DNA用量和/或转染试剂用量。
  • 时间——通过对表达进行时间梯度实验,确定达到最高基因敲低水平的时间点。
  • 应确保双链寡核苷酸插入片段经过测序验证并且不含有突变。
  • shRNA的序列很重要;您可改变shRNA序列的长度、改变环序列/长度、改变shRNA发夹的方向或选择一个不同的目标区域。如果可能,应首先通过瞬时转染筛选shRNA。
  • 应确保加入了足量的四环素。

如果使用重组的慢病毒,请查看以下其他可能性:

  • 转导时未使用Polybrene®试剂——将重组慢病毒转导至细胞时,应使用Polybrene®试剂。
  • 以更高的MOI将慢病毒重组体转导至细胞。
  • 在加入四环素前,使用Zeocin™筛选细胞并生成稳定的细胞系,这样可杀死未转导的细胞,从而改善基因敲低结果。
  • 测定病毒储液滴度。
  • 将病毒储液正确保存在-80°C,冻融次数不超过3次。如果保存时间超过6个月,应在使用前重新滴定。

可以,只要您不使用可表达Tet阻遏蛋白的细胞系,则可实现组成型表达。

选用的shRNA可能无效。应确认shRNA序列不含有3个以上的串联胸腺嘧啶(T),否则会导致转录过早终止。您可尝试选择一个不同的目标区域。检测shRNA的发夹设计。应确保四环素用量正确。为诱导shRNA表达,应在转染后使用四环素处理细胞3-24小时。在诱导后24-96小时,检测目的基因的敲低。最后,请确认重组体被转导至可表达T-REx™阻遏蛋白的细胞中。(为建立可稳定表达Tet阻遏蛋白的细胞系,您可使用pcDNA™6/TR(用于pENTR™/H1/TO重组体)或pLenti6/TR(Lenti4/BLOCK-iT™-DEST重组体),并使用含杀稻瘟菌素的培养基维持细胞。)

慢病毒表达

请查看以下可能原因和解决方案:

筛选转化子时,使用了错误的抗生素

在含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上筛选转化子。

快速BP/LR反应可能对您的插入片段无效

使用标准BP和LR反应。

使用了蛋白酶K处理BP重组反应

在LR反应前,不要使用蛋白酶K处理BP反应。

未使用建议的Gateway® BP和LR Clonase® II Plus酶混合物,或Gateway® BP和LR Clonase® II Plus酶混合物失活

应将酶保存在-20°C或-80°C。酶的冻融次数不要超过10次。使用推荐剂量的酶混合物。另取一份分装的酶混合物进行活性测试。使用DEST载体对阳性对照入门克隆进行测试,确认LR Clonase® II是否有活性。

用于转化的LR反应产物量不足

将2–3 µL的LR反应产物转化到One Shot® Stbl3™化学感受态E. coli中。

转化后混合物铺板量不足

增加铺板量。

在将转化混合物铺板前,未执行1小时孵育生长步骤

在热休克步骤后,加入SOC培养基,并在铺板前将转化混合物置于37°C震荡孵育1小时。

在LR反应中,使用的BP反应物过多

在LR反应中,使用3 µL的BP反应产物。

在LR反应中,未使用pENTR™ 5’启动子载体

在LR反应中,您必须使用提供的pENTR™ 5’启动子载体(或使用您自己构建的含有您感兴趣的启动子的pENTR™ 5’载体)。

有些转化子所含质粒在5’和3’ LTR之间出现了不必要的重组。建议使用我们的One Shot® Stbl3™化学感受态E. coli细胞,因为它们有助于稳定含正向重复序列的慢病毒DNA,通常可减少不必要的重组体。我们建议筛选两种大小的菌落;但是,通常情况下对慢病毒质粒,小菌落可能是正确的克隆。较大的菌落可能是由于发生过重组事件,删除了质粒的部分序列,从而使细胞的生长速度更快。

应确保所用的感受态细胞被正确保存于-80°C,在冰上融化并立即使用。加入DNA时,轻轻混合感受态细胞:不要使用移液管反复吹打混合。同时,转化所用DNA不要超过最大推荐用量(100 ng),或者DNA加入体积不要超过感受态细胞体积的10%,否则会抑制转化。

请查看以下可能原因和解决方案:

原因

解决方案

低转染效率

  • 表达质粒DNA质量差
  • 使用了不健康的293FT细胞
  • 使用含抗生素(即,Geneticin®)的培养基转染细胞
  • 质粒DNA与转染试剂的比例错误
  • 293FT细胞铺板过于稀疏

 

  • 不要使用小量提取的质粒DNA进行转染。我们建议使用PureLink® HiPure质粒DNA纯化小量提取试剂盒来提取质粒DNA
  • 使用传代次数低于20的健康293FT细胞;细胞不可过度生长
  • DNA(µg)与Lipofectamine® 2000(µL)的比例应在1:2至1:3之间
  • 接种适当数量的细胞,使其在转染时达到90–95%汇合度,或者使用推荐的转染方案(即,将细胞加入到含DNA-脂质体混合物的培养基中)

使用不含丙酮酸钠的培养基培养转染细胞

转染后1天,弃去含DNA-脂质体混合物的培养基,然后加入含丙酮酸钠的全培养基。丙酮酸钠可为细胞提供额外的能量来源。

Lipofectamine® 2000试剂的处理方法错误

保存在4°C;不可冷冻。使用前,轻轻颠倒混匀。不要涡旋。

过早收获病毒上清液

通常在转染后48–72小时收获病毒上清液。如果此时仍有很多细胞贴在培养皿上并且形态健康,则应等待24小时再收获病毒上清液。

病毒上清液太稀

使用任意一种可选方法浓缩病毒(Yee,1999)。

病毒上清液冻融多次

病毒上清液的冻融次数不可超过3次。

滴定用细胞选择不当

我们建议使用HT1080细胞。

目的基因对于细胞存活至关重要

通过使用含目标miRNA的入门重组体进行瞬时转染,确认目的基因不是细胞存活或生长所必需的。

滴定过程中未使用Polybrene®试剂

将重组慢病毒转导至细胞时,应使用Polybrene®试剂。

做一个杀死曲线,确定细胞株对抗生素的敏感性。应确保将病毒储液正确保存于-80°C,并且冻融次数不超过3次。最后,使用Polybrene®试剂,将重组慢病毒转导至细胞。

请查看以下可能原因和解决方案:

原因

解决方案

低转染效率

  • 转导时未使用Polybrene®试剂
  • 使用了非分裂细胞

 

  • 将慢病毒重组体转导至细胞时,应使用Polybrene®试剂。
  • 以更高的MOI将慢病毒重组体转导至细胞。

MOI过低

以更高的MOI将慢病毒重组体转导至细胞。

转导后,过早收获细胞和检测

应在转导后48-72小时收获细胞,使表达的miRNA在转导细胞中积累。如果在48小时观察到较低的敲低水平,则延长检测前的细胞培养时间,以完成基因敲低,或对细胞进行杀稻瘟菌素筛选。注意:对细胞进行杀稻瘟菌素筛选,可杀死未转导的细胞,从而改善基因敲低结果。

目的基因对于细胞存活很重要

应确保目的基因不是细胞存活或生长所必需的。

未滴定病毒储液

对慢病毒进行滴定。

病毒储液保存方法错误

分装并保存在-80°C;冻融次数不超过3次;如果保存时间超过6个月,应在使用前重新滴定。

选用的miR RNAi活性较低

选择一个不同的目标区域。使用miR RNAi表达重组体进行瞬时转染,以确定其敲低活性。然后进行慢病毒包装。请注意,一般来说,瞬时转染会使miR RNAi序列严重过表达,因此,当瞬转筛到的是中等活性的表达克隆时,后续包装成慢病毒后敲低活性可能更低。

病毒储液保存方法错误

分装并保存在-80°C。冻融次数不超过3次。

MOI过低

以更高的MOI将重组慢病毒转导至细胞。

有多种原因可导致细胞毒性作用。请查看以下可能原因和解决方案:

原因

解决方案

目的基因对于细胞存活至关重要

应确保目的基因不是细胞存活或生长所必需的。

使用了大体积的病毒上清液进行转导

弃去“营养耗尽”的含病毒培养基,加入新鲜的全培养基;浓缩病毒。

转导时使用了Polybrene®试剂

确认细胞对Polybrene®试剂的敏感性;如果细胞很敏感,则不要使用Polybrene®。

使用过多的杀稻瘟菌素进行筛选

通过杀死曲线实验,确定您的细胞对杀稻瘟菌素的敏感性。使用杀死未转导细胞所需的最低杀稻瘟菌素浓度。

所用目标序列可能与其他基因具有较高的同源性;请选择一个不同的目标区域。

请使用推荐的滤波装置对所用荧光进行检测。使用倒置荧光显微镜进行分析。如有需要,可使蛋白表达持续1-3天,再进行荧光检测。

腺病毒载体表达

以下是可能原因和解决方案:

原因

解决方案

筛选转化子时,使用了错误的抗生素

在含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上筛选转化子。

未使用蛋白酶K处理LR重组反应

在转化前,使用蛋白酶K处理反应。

pAd/BLOCK-iT™-DEST质粒DNA被剪切

处理腺病毒目的载体时,应小心。不要进行可能会剪切DNA的多余操作(如,涡旋或用力吹打)。

未使用推荐用量的LR Clonase® II酶混合物或LR Clonase® II酶混合物失活

-应将LR Clonase® II酶混合物保存在-20°C。

-LR Clonase® II酶混合物的冻融次数不可超过10次。

-使用推荐用量的LR Clonase® II酶混合物(见使用手册第14页)。

-另取一份分装的LR Clonase® II酶混合物进行活性测试。

用于转化的LR反应产物不足

将2–3 µL的LR反应物转化到合适的感受态E. coli菌株中。使用转化效率>1 x 108 cfu/μg的E. coli细胞。

转化混合物铺板量不足

增加E. coli铺板量。

LR反应使用了过多的入门克隆DNA

在LR反应中,使用50–150 ng的入门克隆。

以下是可能原因和解决方案:

原因

解决方案

将LR反应产物转化到了含F’游离体和ccdA基因的E. coli菌株中

使用不含F’游离体的E. coli菌株进行转化(如,TOP10和DH5α-T1R)。

pAd/BLOCK-iT™-DEST载体中的ccdB基因缺失(全部或部分)

腺病毒DEST载体是以溶液形式提供的,可立即用于LR反应。但是,如果您想对其进行扩增:

propagate them:

-使用含100 μg/mL氨苄青霉素和15–30 μg/mL氯霉素的培养基筛选转化子,从而维持载体的完整性。

-从一个或多个菌落中提取质粒DNA,使用前应确认载体的完整性。

以下是可能原因和解决方案:

原因

解决方案

低转染效率

-pAd/BLOCK-iT™-DEST表达克隆质粒DNA被剪切

-PacI消化不完整或经消化的DNA被苯酚、乙醇或盐污染

-293A细胞不健康;细胞存活率较低

-转染前一天,293A细胞接种过于稀疏

-质粒DNA与转染试剂的比例不正确

 

-处理质粒DNA时,应小心。不要进行可能会剪切DNA的多余操作(如,涡旋或用力吹打)。

-重复PacI消化。应确保纯化的DNA未被苯酚、乙醇或盐污染。

-使用健康的293A细胞;细胞不可过度生长。

-转染时,细胞应达到90–95%汇合度。

-优化转染条件,使质粒DNA(µg)与Lipofectamine® 2000(µL)的比例在1:2至1:3之间。如果您在使用其他转染试剂,则应根据生产商的建议进行优化。

病毒上清液太稀

使用氯化铯纯化法或任意一种可选方法浓缩病毒。

病毒上清液冻融多次

病毒上清液的冻融次数不可超过10次。

以下是可能原因和解决方案:

原因

解决方案

病毒储液保存方法错误

分装并保存在-80°C。冻融次数不可超过10次。

滴定所用的细胞错误

使用293A细胞或任何具有使用手册第23页所述特性的细胞。

覆层琼脂糖准备不当

琼脂糖在加到细胞前不可过热;热的琼脂糖会杀死细胞。

这可能是因为对病毒上清液稀释不足。我们建议先10倍连续稀释病毒储液(范围为10–4至10–9)再对腺病毒储液进行滴定。

以下是可能原因和解决方案:

原因

解决方案

病毒储液保存方法错误

分装并保存在-80°C。冻融次数不可超过10次。

目的基因含有PacI位点

通过诱导突变而改变或除去PacI位点。

选用的shRNA无活性

选择一个不同的目标区域。如果可能,应先通过瞬时转染筛选shRNA。

MOI过低

以更高的MOI将重组腺病毒转导至细胞。

以下是可能原因和解决方案:

原因

解决方案

转导效率低:

-哺乳细胞不健康

-使用了非分裂细胞

 

-转导前,应确保细胞是健康的。

-以更高的MOI将腺病毒重组体转导至细胞。

MOI过低

-以更高的MOI将腺病毒重组体转导至细胞。

病毒滴度较低

采用使用手册第27页的操作步骤,扩增腺病毒储液。

选用的shRNA活性较低

选择一个不同的目标区域。如果可能,应先通过瞬时转染筛选shRNA。

腺病毒储液被RCA(可复制的腺病毒)污染

-筛查RCA污染。

-制备新的腺病毒储液或通过空斑纯化法分离重组腺病毒。

转导后,过早收获细胞

应在转导后48-72小时收获细胞,使表达的shRNA在转导细胞中积累。

转导后,过晚收获细胞

对于活跃的分裂细胞,在转导后5天内可检测到重组蛋白的最高表达水平。

敲低目的基因导致细胞死亡

应确保您的目的基因不是细胞存活或生长所必需的。

以下是可能原因和解决方案:

原因

解决方案

使用了过多的粗制病毒储液

-转导时减少粗制病毒储液的用量或稀释粗制病毒储液。

-扩增腺病毒储液。

-浓缩粗制病毒储液。

野生型RCA(可复制的腺病毒)污染

筛查RCA污染。通过空斑纯化法分离重组腺病毒,或制备新的腺病毒储液。

需要了解更多信息?敬请联系我们 ›