Image-iT™ Fixative Solutions

Image-iT Fixierlösungen sind gebrauchsfertige Lösungen, die in verschiedenen Formaten für unterschiedliche Forschungsanforderungen bereitgestellt werden. Sie sind ideal für die Verwendung mit Fluoreszenzproteinen, GFP und RFP sowie anderen kleinen Farbstofffluorophoren. Kein Mischen toxischer Fixierpulver oder Verdünnen konzentrierter Lösungen mit nicht optimalem pH-Wert mehr.  Diese Fixierlösungen lassen sich einfach zu Zellen/Gewebe zugeben und werden dann 10 bis 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Sie sind ideal für die Verwendung mit allen antikörperbasierten Nachweismethoden, einschließlich Immunzytochemie (ICC), Immunfluoreszenz (IF) und Immunhistochemie (IHC).

Merkmale von Image-iT Fixierlösungen:
• Gebrauchsfertig
• Hochgradig reine Fixiermittel in Bildgebungsqualität mit minimalen Hintergrundsignalartefakten
• Methanolfrei
• Optimiert für die Markierung von Sekundärantikörpern, Färbung fixierter Zellfarbstoffe und die kolorimetrische IHC

Fixierlösungen mit 4 % Formaldehyd oder Paraformaldehyd
4 % Formaldehyd und Paraformaldehyd sind die am häufigsten verwendeten Fixiermittel für Immunzytochemie (ICC), Immunfluoreszenz (IF) und Immunhistochemie (IHC).  Image-IT™ Paraformaldehyd 4 % in 0,1 mol Phosphatpuffer, pH-Wert 7,4 (Kat.- Nr. I28800), wird in zehn Fläschchen mit jeweils 10 ml geliefert. Image-iT™ Formaldehyd 4 % in PBS wird in 20 ml-Größe (Kat.- Nr. FB 002) oder 5 x 20 ml-Größe (Kat.- Nr. R37814) geliefert. Paraformaldehyd/Formaldehyd 4 % in 0,1 mol Phosphatpuffer hat ∼300 mOsm weniger Osmolarität als in PBS, was zum Aufrechterhalten der Zellmorphologie beiträgt, bevor das Fixiermittel die inneren Zellkompartimente fixieren kann. Für Paraformaldehyd/Formaldehyd in PBS- oder Phosphatpuffer einfach das Fixiermittel zu den Zellen hinzufügen und dann 5 bis 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation in PBS und fahren Sie dann mit dem Blockierschritt fort.

Paraformaldehyd 3 %, Glutaraldehyd 0,35 % Fixierlösung
3 % Paraformaldehyd mit 0,35 % Glutaraldehyd ist eine gebrauchsfertige Lösung, die in 0,1 mol Natriumcacodylatpuffer ohne Methanol geliefert wird. Yuan Qin, et al. (1) stellten fest, dass eine Mischung aus Paraformaldehyd und Glutaraldehyd die mitochondriale Morphologie besser konservieren kann als die jeweils einzelnen Substanzen.

Paraformaldehyd ist ein kleines Molekül, das Zellen/Gewebe schnell durchdringt und Proteine und andere Moleküle fixiert. Glutaraldehyd ist ein größeres Molekül mit zwei reaktiven Aldehydgruppen, die das Fixierungspotenzial erhöhen und beim Erzeugen langer Ketten aus Glutaraldehyd helfen, wodurch eine Matrix entsteht. Diese Fähigkeit hilft beim Aufrechterhalten der Lokalisierung von Proteinen in komplexen Umfeldern wie Mitochondrien.

Zum Fixieren von Zellen/Gewebe werden 5 bis 10 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur empfohlen. Bei Glutaraldehyd ist aufgrund des erhöhten Vorhandenseins reaktiver Aldehydgruppen eine erhöhte Eigenfluoreszenz beobachtbar. Zum Reduzieren dieser Eigenfluoreszenz wird nach der Fixierung, aber noch vor dem Blockieren eine Inkubationszeit von ca. sieben Minuten mit 0,1 mol Glycin oder frisch zubereitetem 0,1 % (Volumengewicht) Natriumborhydrid empfohlen.

Glyoxal 3 % Fixierlösung
Glyoxal 3 % Fixierlösung ist gebrauchsfertig und wird in zwei Teilen geliefert.  Einfach die beiden Teile 1:1 mischen, den pH-Wert mit NaOH auf 4,5 einstellen und verwenden. Glyoxal ist ein kleineres Molekül als Formaldehyd oder Glutaraldehyd. Es dringt schnell in Zellen/Gewebe ein, fixiert die Proteine und bewahrt die Zellmorphologie besser als Formaldehyd (2). Glyoxal 3 % Fixierlösung besteht aus 2 Flaschen: Lösung A & Lösung B, enthält absolutes Ethanol, Glyoxallösung, Essigsäure und Wasser. In einem leeren Fläschchen Lösung B mit der gleichen Menge Lösung A versetzen, die beiden Lösungen miteinander vortexen und mit 1 mol NaOH einen pH-Wert von 4,5 einstellen. Diese Lösung muss sofort nach dem Mischen verwendet werden. Zum Fixieren der Zellen/des Gewebes, Zellen/Gewebe bei Raumtemperatur ca. 10 Minuten lang inkubieren. Ungemischte (aber angebrochene) Lösungen in den Flaschen sind stabil und bis zum Verfallsdatum auf dem Etikett verwendbar.

Literatur
1: Qin Y, Jiang W, Li A, Gao M, Liu H, Gao Y, Tian X, Gong G. The Combination of Paraformaldehyde and Glutaraldehyde Is a Potential Fixative for Mitochondria. Biomolecules. 2021 May 10;11(5):711.
2: Richter KN, et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. EMBO J. 2018 Jan 4;37(1):139-159.