El sistema de clonación y expresión LIC Thermo Scientific aLICator™ está diseñado para una clonación independiente de ligadura rápida y eficaz y una regulación estricta de la expresión génica en E. coli. Los vectores de expresión bacteriana pLATE están diseñados para altos niveles de expresión de proteína objetivo de forma coordinada con una mínima expresión de fondo (no inducida), lo que permite la expresión de proteínas que son tóxicas para las células de E. coli. Para agilizar y facilitar el proceso de clonación de inserción en el vector de expresión, el sistema aLICator utiliza tecnología de clonación LIC direccional, un procedimiento rápido que proporciona una alta eficacia de clonación.

La expresión fuertemente regulada y la clonación direccional rápida y eficiente hacen que el sistema de clonación y expresión LIC de aLICator sea la mejor opción para la clonación y expresión génica rutinaria y tóxica en E. coli.

Características destacadas

• Clonación LIC de gran eficiencia
• Control estricto de la expresión génica
• Expresión de alto rendimiento
• Expresión de proteínas versátil con etiqueta o sin etiqueta, con opción de eliminación de etiquetas

Aplicaciones

• Clonación direccional de productos de PCR
• Expresión de proteínas fuertemente regulada
• Expresión de genes tóxicos

Principio

El sistema de clonación LIC de aLICator utiliza tecnología de clonación LIC direccional para optimizar y facilitar la clonación en un vector de expresión. LIC garantiza una alta eficacia de clonación de más del 95 % y elimina la necesidad de ligación y restricción de los pasos de digestión enzimática.

El método LIC utiliza ADN polimerasa T4 para crear específicos de 14 a 21 nucleótidos de una sola cadena de salientes en los vectores pLATE y los insertos de ADN. El ADN polimerasa T4 tiene dos actividades enzimáticas: Actividad de la polimerasa 5'→3' y actividad exonucleasa 3'→5'. La actividad exonucleasa elimina los nucleótidos de los extremos 3' del ADN, mientras que la actividad de la polimerasa restaura la cadena utilizando los dNTP y la cadena de ADN complementaria como plantilla. En el protocolo LIC, solo se incluye dGTP en la reacción, lo que causa que las actividades exonucleasa 3'→5’ y polimerasa 5'→3’ se equilibren en la primera aparición de citosina en la cadena complementaria. Después del recocido, el vector LIC y el inserto se transforman en células competentes de E. coli sin el uso de la ligasa de ADN T4. La formación de enlace covalente en las uniones de vector e inserto ocurre dentro de la célula para producir plásmido circular.

Características

El sistema consta de cuatro kits basados en la serie de vectores de expresión bacteriana pLATE:

• Kit 1 de clonación y expresión LIC aLICator™: vector pLATE11, expresión de proteínas sin etiquetar.
• Kit 2 de clonación y expresión LIC aLICator™ (etiqueta His de terminación de tipo N/EK): vector pLATE51, expresión de proteína de etiqueta His de terminación de tipo N.
• Kit 3 de clonación y expresión LIC aLICator™ (etiqueta His de terminación de tipo C): vector pLATE31, expresión de proteína de etiqueta His de terminación de tipo C.
• Kit 4 de clonación y expresión LIC aLICator™ (etiqueta His de terminación de tipo N/WQ): vector pLATE 52, expresión de proteína de etiqueta His de terminación de tipo N, escisión WELQut.
• Conjunto 1 de clonación y expresión LIC aLICator™ (todo en uno/EK): vectores pLATE11, pLATE51 y pLATE31, elección de expresión sin etiquetar, expresión de proteínas de etiqueta His de terminación de tipo N o C.
• Conjunto 2 de clonación y expresión LIC aLICator™ (todo en uno/WQ): vectores pLATE11, pLATE52 y pLATE31 vectores, elección de no etiquetar, expresión de proteína con etiqueta His de terminación de tipo N o C, escisión WELQut.

Para las proteínas con una preferencia conocida por la posición de la etiqueta 6xHis de la terminación de tipo N o C se recomienda utilizar el kit de terminación de tipo N o C apropiado. Cuando no se conocen bien la estructura y las características de las proteínas, se recomienda clonar en los tres vectores y determinar el vector más compatible para realizar más investigaciones.

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