Fixing and permeabilizing cells

固定和透化处理基础知识

固定和透化处理细胞时,通常会将其锁定,然后使抗体等较大的分子可以进入细胞内部,从而更好地靶向您感兴趣的蛋白和环境,但固定和透化处理的细胞都已死亡,因此您无法再观看到动态的生物过程。

以下信息有助于帮助您了解固定和透化是否对您的检测对象进行了正确处理。

浏览 固定, 、透化 及封闭 实验方案

使用固定和透化处理的细胞进行成像

  • 细胞状态保留在某个时间节点
  • 细胞变得通透可允许大分子进入
  • 可以保护并稳定总的细胞结构
  • 靶标不会移动,更易于成像

  • 由于固定处理,蛋白构造可能发生变化
  • 大多数酶都已失活
  • 细胞内的可溶性成分可能会丢失
  • 动态过程可以提供更多的功能信息

固定

Schematic drawing of a cell

图1. 甲醛固定基本上锁定了细胞结构。

在细胞固定之后,荧光染料产生信号的能力会出现变化。对于部分染料,可以先标记活细胞,然后再在不损失信号的前提下将其固定。但通常最常用的方法是固定、透化并封闭细胞,然后采用荧光染料和/或抗体偶联物对其进行染色。

甲醛是最常用的固定剂;其通过与毗邻的蛋白质等大分子化学结合到一起,起到固定作用,这一过程被称为交联。目前的大多数甲醛制备物实际上都是溶解在水或缓冲液中的多聚甲醛(PFA),最终的溶液之中的游离甲二醇与蛋白质和其他含有氮的细胞结构上的胺基具有反应性。PFA还可以溶解细胞膜内的部分脂质体。PFA通常稀释为3.7–5% v/v,并需处理细胞10-15分钟。

尽管甲醛与大多数蛋白质、多肽和酶具有广泛的反应性,且是最常用的醛类,但如果甲醛不适合您的靶标,您也可以使用其他方法;戊二醛可单独用作强交联剂,或者结合甲醛使用,但戊二醛处理的样品在使用抗体进行标记前需要进一步处理;对于膜表面抗原,有些情况下建议使用冷乙醇固定方法。

透化

透化步骤将会去除细胞膜脂质体,从而允许抗体等较大的分子进入到细胞内部。0.1–0.5%(体积比,溶解在PBS内)的Triton X-100和NP-40为常用的透化洗涤剂。透化时间10-15min是较好的起始点,但如果这种处理不太适合您的靶标,则可能需要尝试缩短时间或使用其他洗涤剂。此类除垢剂还可以透过细胞核膜,因此适于各种靶标位置。

图2. 在透化步骤去除细胞膜脂质体后,将允许较大的分子进入到细胞内部。

permeabilization reagent breaks down cell membranes
疑难解答
如果您只是观察位于细胞膜上的靶标,则可能需要完全跳过透化步骤,或者尝试使用皂素、Tween 20或洋地黄皂苷等较温和的洗涤剂并缩短透化时间。如果Triton X-100或NP-40无法使您的靶标很好地可视化,可以尝试这些在0.1–0.5% (v/v)浓度下处理5-10分钟。

封闭

blocking agent works to prevent the primary or secondary antibody probe

图 3. 使用基于蛋白质的封闭剂减少了非特异性染色。

如果您想用抗体标记固定和透化的细胞内结构,最好能在标记一抗之前使用封闭溶液。封闭步骤通常通过含有能够抑制样品非特异性结合的过量蛋白质的溶液进行。如果您的一抗或二抗很容易与样品内非靶标的分子反应,进行这种处理就很有必要。减少非特异性的“背景”染色(多数由于抗体和非靶标分子之间的疏水作用造成),可使您更轻松地鉴别阳性信号,获得更清晰的最终结果。

ICC最常用的封闭溶液类型为3% (w/v)的牛血清白蛋白PBS溶液和/或10% (v/v)的热灭活种属特异性血清PBS溶液——其中的血清种属需与二抗种属相匹配。例如,如果您使用小鼠抗兔IgG二抗,则可选择正常热灭活的小鼠血清制备封闭剂。

blocking agent preventing nonspecific antibody interactions at nontarget sites

图 4. 基于蛋白质的封闭剂有助于减少非特异性染色。抗体能够取代封闭蛋白形成表位高度亲和键,同时封闭蛋白可以防止低亲和力抗体在样品其他位置反应。

您可以在封闭溶液中孵育样品至少60分钟,也可以在室温或冰箱中过夜。完成封闭步骤后,如果您不立即标记抗体,务必要采用PBS洗涤的方法去除多余的封闭溶液。

疑难解答
如果在成像前未能去除多余的封闭溶液,可能会产生非特异性背景荧光,在所有成像区域出现明亮的干扰信号。

通常很难确定在多步骤实验中的哪些环节出现了错误,免疫荧光也不例外。免疫荧光实验结果不良最可能的原因是一抗(类型和/或浓度有误)或二抗(浓度有误)。有关如何帮助您优化自己的实验结果的方法,请阅读实验对照的“抗体免疫标记”。

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