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概述

我们建议至少选取一种酶切后产生粘性末端的酶以使得插入片段具有方向性。

您可以设置所有下列对照或者根据面对的问题选择一个您认为最合适的对照:

  1. 使用环状质粒转化E.coli以评估感受态细胞的转化效率(它们获得DNA的能力如何)。
  2. 使用去磷酸化的载体进行转化和涂板。这将告诉你去磷酸化是否彻底以及在连接转化涂板后多大比例的克隆可能是假阳性(重新连接的载体或背景)。
  3. 使用T4 DNA连接酶重新连接酶切后的载体,或者lambda DNA/Hind III标记物。这将帮助你评估连接酶本身是否正常工作。

对载体进行去磷酸化以降低背景时可以使用:

如果需要获得磷酸化的DNA平末端(“补平”末端),您可以使用:

  • 可以用DNA End Repair Mix或T4 DNA 聚合酶或E. coli DNA聚合酶Klenow片段(大片段)来产生平末端,因为它们有5’ →3’DNA聚合酶活性(补齐5’突出端)和3’→5’外切酶活性(切除3’突出端)。

酶切消化

通常,1单位的酶在50微升溶液内消化1微克lambda DNA需要在37摄氏度孵育1小时。请参考用户手册查看您所用的酶所需的特殊温度/时间要求。

如果你能找到3种酶均具有足够活性的缓冲液(通常不低于50%),那么你可以设置同时三种酶的酶切反应。重要的一点是加入反应体系的酶的总体积不能超过反应总体积的十分之一。这样做的原因是当反应体系内甘油浓度超过5%时有些酶显示出星号活性。如果你不能找到3种酶都具有足够活性的某种缓冲液,你将需要使用单独的酶对质粒进行顺次酶切。

连接

请考虑以下建议:

  1. 尝试不同的插入片段对载体的摩尔比。使用过量的插入片段通常会获得成功,试试1:1到15:1的插入片段:载体比例。
  2. 尝试增加连接反应在37摄氏度的孵育时间。
  3. 尝试在16摄氏度进行连接过夜(你可以在PCR仪上设置这一反应)。
dATP是一个竞争性抑制剂。磷酸基团将降低连接效率。连接缓冲液中的去垢剂可能不会影响酶活性。高浓度(0.2 M)的Na2+, K+, Cs+, Li+, 和NH4+几乎可以完全抑制酶活性。多胺、精胺和亚精胺也是抑制剂。

我们提供T4 DNA连接酶(提供1 unit/μL5 units/μL两种规格)和ExpressLink™ T4 DNA连接酶。

两种酶的主要区别是E. coli DNA连接酶不能连接平末端dsDNA片段。两种酶均可用于修复双链DNA的单链切口以及进行粘末端连接。E. coli DNA连接酶通常被用于在第二链cDNA合成时进行切口修复,因为T4 DNA连接酶可能会导致嵌合插入的形成。

ExpressLink™ T4 DNA连接酶是一种能在室温条件下5分钟内催化平末端或粘末端DNA片段连接,或者在15分钟内催化带有A突起的PCR片段连接的T4 DNA连接酶。ExpressLink™ T4 DNA连接酶经过了严格的外切酶质量控制检验以实现无外切酶活性的连接。该酶以5 units/μL的浓度提供。

你可能需要尝试从1:1到15:1的插入片段:载体比例。

Equation:

Formula

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