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关于CRISPR的常见问题

仔细设计crRNA靶向序列并避免与基因组其它区域有同源性对于降低脱靶效应是非常关键的。

很不幸,PAM序列对于CRISPR基因编辑是必须的。但是,如果没有PAM序列可用时,您可以使用我们的Invitrogen™ GeneArt™ Precision TAL效应因子核酸酶系统

有一些方法可以帮助提高效率,例如,加入抗生素选择和/或使用流式细胞仪分选以富集被转染的细胞都会对提高效率有所帮助。

Invitrogen™ GeneArt™ CRISPR核酸酶载体试剂盒

请看下列建议:

  • 使用高质量的、纯化的质粒DNA进行测序。我们建议使用Invitrogen™ PureLink™ HQ Mini质粒纯化试剂盒纯化DNA。向测序反应中加入DMSO至终浓度5%。
  • 提高用于测序反应的模板量(可提高至通常浓度的两倍)。
  • 在测序反应中使用7:1摩尔比的dITP:dGTP。

原因

解决方法

单链(ss)寡核苷酸设计不正确

确保每个ss寡核苷酸均在3’末端包含用于克隆到GeneArt CRISPR核酸酶载体上的5个核苷酸:

正义链3’末端包含GTTTT

反义链3’末端包含CGGTG

双链(ds)寡核苷酸被降解

将5 nM ds寡核苷酸存储于1X寡核苷酸退火缓冲液中

避免反复冻融;将5 nM ds寡核苷酸储存液分装并包存于–20°C

寡核苷酸退火反应效率过低

确保根据实验说明进行退火反应

如果环境温度>25°C,则需要在25°C温箱内进行退火反应。

Invitrogen™ GeneArt™ Genomic Cleavage Selection试剂盒

可能的原因和建议如下:

原因

解决方法

单链(ss)寡核苷酸设计不正确

确保每个ss寡核苷酸均在5’末端包含用于克隆到GeneArt Genomic Cleavage Selection载体上的4个核苷酸

正义链5’末端包含AATT

反义链5’末端包含CTAG

双链(ds)寡核苷酸被降解

将50nM ds寡核苷酸存储于1X寡核苷酸退火缓冲液中置于–20°C

避免反复冻融;将50nM ds寡核苷酸储存液分装并保存于–20°C

寡核苷酸退火反应效率过低

确保根据实验说明进行退火反应

如果环境温度>25°C,则需要在25°C温箱内进行退火反应。

这种情况发生的原因是:

  • 寡核苷酸设计不正确;请确保包含针对TALEN/CRISPR靶点的特异性序列
  • 转染效率过低;优化条件或使用Lipofectamine 3000或2000试剂以获得最佳结果
  • 细胞系原因;OFP在某些细胞系内表达不是很好;我们建议使用293FT细胞测试剪切活性。

OFP背景过高可能是因为质粒污染,或者可能是细胞系或靶点原因造成的。在培养含有剪切筛选质粒的细胞时,确保挑取单克隆,或者可以尝试降低转染时所用的载体量。

结果根据剪切位点不同而不同。我们建议使用GeneArt 基因组剪切检测试剂盒(货号A24372)来确认对于内源基因组位点的剪切。

Invitrogen™ GeneArt™ 基因组剪切检测试剂盒

请看下表所列的常见问题、可能原因以及建议:

DNA条带表型

可能原因

建议

弥散

裂解物浓度过高

将裂解物稀释2至4倍然后再次进行PCR反应。

条带过暗

裂解物过度稀释

在PCR反应中使用2倍量的裂解物。不要在PCR反应中使用超过4 µL的裂解物。裂解物会抑制PCR反应。

不同扩增子之间条带亮度有差异

不同样本间裂解物浓度不同

盒纯化PCR产物。欲获得样本比较的最佳结果,请在每个剪切实验中使用相同量的DNA。每个反应使用50 ng至100 ng DNA已经足够。

无PCR产物

PCR引物设计不佳或剪切位点位于GC富集区域

重新设计引物,长度为18–22 bp,GC含量45–60%,并且Tm范围在52–58°C。对于GC富集区域,向50 µL反应体系内加入1–10 µL的360 GC Enhancer 并再次进行PCR扩增。

请看下表所列的常见问题、可能原因以及建议:

问题

可能原因

建议

没有可见的剪切条带

核酸酶不能到达目标序列或不能剪切目标位点

转染效果过低

在临近的序列设计新的靶向策略

基因组修饰效率过低

优化转染实验方案

没有进行变性和退火步骤

使用试剂盒内的对照模板和引物验证试剂盒的成分和实验步骤。

分析凝胶数据遇到困难

检测剪切条带受到背景的干扰

重新设计PCR引物以获得区分明显的剪切条带谱型

非特异性剪切条带

目标位点有复杂突变

酶切孵育时间过长。

加入了过多的检测酶。

检测酶对于某些目标位点的非特异性剪切。

重新设计PCR引物以扩增目标序列。

使用未转染或非相关质粒转染的细胞裂解物作为阴性对照以区分背景和特异性剪切。

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