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通用问题

我们提供三种主要的质粒纯化技术:离子交换,硅胶膜,以及ChargeSwitch®技术。

260nm吸收值和280nm吸收值的比值(A260/A280)通常被用来判定样本的纯度。对于DNA而言,理想的比值是1.8,但是可以接受的范围为1.7–1.9。A260/A230也经常被用来确定是否存在污染。DNA的A260/A230理想值为1.8–2.0。DNA的纯度也可以用凝胶电泳检测。对于质粒DNA而言,应出现一条明显的单一条带(可能会出现几条额外条带,代表质粒分子的多种形式)。

离子交换纯化推荐用于需要高纯度和低内毒素水平的实验。硅胶纯化的质粒用于转染不是最佳选择,因为其中有较高水平的内毒素和杂质。离子交换柱对于纯化大分子量的质粒效果也更佳。

内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁最外层的一部分,对宿主细胞是有毒性的。内毒素会影响哺乳细胞的生长、分化、收缩以及蛋白表达。在细菌细胞裂解过程中,内毒素被释放出来,它能降低转染效率并影响后续的蛋白表达水平。使用我们的PureLink® HiPure质粒试剂盒纯化得到的质粒DNA具有和无内毒素试剂盒相同的内毒素水平(0.1 EU/µg),非常适合下游应用。请参阅下列文章以获得有关内毒素的更多信息:Butash KA et al. (2000) Reexamination of the effect of endotoxin on cell proliferation and transfection efficiency. Biotechniques 29(3): 610-614, 616, 618-619.

是的,我们提供EveryPrep™通用多头抽真空装置(Cat. No. K2111-01),可以使用ChargeSwitch® Pro Filter Plasmid Mini, Midi, 和Maxi试剂盒直接从该装置上真空洗脱。

Here is a list of DNA/RNA Purification replacement buffers we offer as standalone.

质粒的柱纯化

所有被称为“HiPure”的试剂盒均使用离子交换树脂以分离高质粒的质粒DNA,适用于进行转染。Filter试剂盒包含一个滤器以去除细菌裂解物而无需离心,而HiPure FP包含一个滤器和一个沉淀器,从而在去除细菌裂解物和进行DNA沉淀时均无需离心。

是的,PureLink® HiPure Plasmid试剂盒可以提取BAC DNA, bacmid DNA, cosmid DNA, 或M13 ssDNA。请参阅使用手册获取详细的步骤。

我们推荐使用我们的PureLink® Quick Plasmid试剂盒。该试剂盒使用硅膜柱,带有快速提取步骤(大约需要45分钟的离心)。虽然提取的质粒纯度低于使用PureLink® HiPure提取的质粒,但是它适用于测序和克隆。

“HQ”代表“高质量”硅膜柱,相比PureLink® Quick Plasmid试剂盒,PureLink® HQ试剂盒可以提供纯度略高的质粒DNA。使用PureLink® HQ硅膜柱纯化的质粒其内毒素单位小于40 EU/µg。使用PureLink® HQ试剂盒纯化的质粒DNA适用于克隆,测序,以及一些转染实验。

对于任何硅膜柱,使用水进行洗脱通常都是可行的。使用缓冲液的优点是吸光度的读值会比较稳定和精确,因为纯水的pH值可能会很低(pH4-5)。

我们不建议降低洗脱缓冲液的体积,因为这将导致产量下降。你可以进行一次额外的洗脱以提高产量。

请参阅下表获知我们的典型产量信息:

柱规格

过夜菌培养液体积

高拷贝质粒大致产量

Miniprep

1–3 mL

最高30 µg

Midiprep

25–100 mL

最高150 µg

Maxiprep

100–500 mL

最高750 µg

Megaprep

0.5–2.5 L

最高2.5 µg

Gigaprep

2.5–5 L

最高10 mg

PureLink® HiPure Mini, Midi, 以及Maxi试剂盒可以纯化最大200 kb的质粒,而PureLink® HiPure Mega和Giga试剂盒可以纯化最大150kb的质粒。

是的,请参阅以下详细步骤:

  1. 使用2 mL (mini)/10 mL (midi)/30 mL (maxi) EQ1缓冲液平衡纯化柱。
  2. 收集噬菌体裂解物(液体或固体裂解物)并确定准确体积。
  3. 根据体积,加入30 μL/100 μL/400 μL缓冲液X1至10 mL/50 mL/250 mL 噬菌体裂解物中并在37°C孵育30 min。
    X1 = 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 20 mg/mL RNase A, 6 mg/mL DNase I
  4. 将第3步中的核酸酶消化产物和2 mL/ 10 mL/50 mL冰预冷的缓冲液X2混合,冰上孵育60min。
    X2 = 3 M NaCl, 30% (w/v) polyethyleneglycol (PEG) 6000
  5. 在>10,000 x g离心10分钟以收集噬菌体颗粒。弃上清。
  6. 用1 mL (mini)/3 mL (midi)/9 mL (maxi)缓冲液X3重悬噬菌体颗粒。
    X3 = 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 25 mM EDTA
  7. 向噬菌体悬液中加入1 mL (mini)/3 mL (midi)/9 mL (maxi)的缓冲液X4。上下颠倒几次充分混匀并在70°C孵育10 分钟 (mini)或20 分钟 (midi and maxi)以裂解噬菌体颗粒。
    X4 = 4% (w/v) SDS
  8. 向裂解物中加入1 mL (mini)/3 mL (midi)/9 mL (maxi)缓冲液X5,颠倒混匀,在≥13,000 x g室温离心10分钟。收集上清,避免吸取太多颗粒,然后直接将其加入平衡后的纯化柱内(见第1步)。让裂解物依靠重力进入树脂内。
    X5 = 3.0 M 乙酸钾 (用乙酸调节至pH 5.5)
  9. 用2 x 2.5 mL (mini), 2 x 10 mL (midi), 或1 x 60 mL (maxi)缓冲液W8洗柱。
  10. 用0.9 mL (mini)/5 mL (midi)/15 mL (maxi)缓冲液X6洗脱lambda DNA并加入平衡至室温的0.7倍体积异丙醇沉淀DNA。
  11. 在≥13,000 x g,4°C离心30分钟。因为lambda DNA很粘,所以如果使用的是固定转角离心机则DNA将扩散至整个试管壁。因此,我们推荐使用水平转子离心机(例如HB-4或HB-6 Sorvall离心机),或者,如果没有此类转子,使用二甲基二氯硅烷硅化的离心管(如Corex)。
    离心结束后,用80%乙醇洗涤lambda DNA并短时放置使其干燥。然后将lambda DNA溶解于适当体积的TE或10 mM Tris缓冲液(pH 8.0)中。
  1. 革兰氏阳性菌的裂解条件变化很大,所以你可能需要使用一个已知适用于你所使用的细菌的特殊裂解步骤。试剂盒中提供的裂解材料可能不适合。
  2. 使用特殊方法裂解后,用70%乙醇或异丙醇对粗提的质粒DNA进行沉淀。确保除去基因组DNA(根据包装内的说明卡片上的提示进行,任何时候都不要进行涡旋混匀)。
  3. 将离心后的核酸沉淀重悬于较小体积的600 mM NaCl, 100 mM乙酸钠, pH 5.0的缓冲液中(1 mL/mini, 10 mL/ midi, 24 mL/maxi)。
    将上述溶液加入平衡后的纯化柱中,根据标准流程继续完成后续步骤。

是的,请根据以下建议步骤进行:

  1. 使用通常的哺乳动物细胞裂解程序裂解细胞,例如,碱裂解。请注意,这一步必须轻柔,因为断裂的基因组DNA将和质粒一起被纯化出来。
  2. 使用乙醇或70–80%异丙醇沉淀DNA。这是一个粗沉淀的步骤。
  3. 将上述沉淀物重悬于600 mM NaCl, 100 mM NaOAC, pH5.0的缓冲液中。
  4. 将上述溶液加入平衡后的HiPure纯化柱中。

上述步骤适用于提取最大100kb的质粒。需注意的是线粒体DNA也同时被纯化出来。

我们通常建议在LB培养基中培养E. coli至1–1.5 A600 units/mL (~1 x 109 cells/mL)。

基于磁珠的质粒纯化

ChargeSwitch®技术的特征是带电荷磁珠表面和核酸的结合会随着周围缓冲液pH值的变化,就像“开关”一样可控。在低pH值条件下,该结合表面带正电从而结合带负电的核酸,因而可以用一个简单的洗涤步骤去除蛋白和其它污染物。

请点击此处链接通过一张表格了解ChargeSwitch®试剂盒所突破的传统质粒纯化方法存在的哪些局限。

通常而言ChargeSwitch® Pro mini试剂盒从5mL菌液可得到25 µg质粒,midi试剂盒从25 mL菌液可得到100–200 µg质粒,而 maxi试剂盒从100 mL菌液可得到500–1,000 µg质粒。试剂盒可以纯化的质粒大小范围通常是3–9 kb。

带filter的试剂盒是基于一个双巢式柱的设计,它能够有助于通过最快最简便的步骤获得高质量的质粒( (<10 EU/µg DNA)。经过改良的缓冲液1可去除更多内毒素。

自动化的质粒纯化

是的,我们提供BenchPro® 2100质粒纯化系统,它是一个完全自动化的大抽纯化系统。

虽然根据您的质粒的大小和拷贝数的不同以及菌种的不同,产量和纯度会有差异,但是我们在几种常用菌种包括C600, DH10B/T1R, DH5alpha, JM109, TOP10, 及XL1-Blu中测试了一种高拷贝质粒(pcDNA3.1),证明平均产量超过500 µg。

MC5001重量轻而且占地小。它包括一个干燥单元,是一个双功能的除湿和膜干燥器。它的噪音水平是60 dB。它在一般的放有 –80°C冰箱和通风橱的实验室工作良好。MC6001是我们的超静音,油填充式的压缩机。它比MC5001重而且高。它也带有相同的干燥单元以降低湿度。

对于LB培养基,你可以向菌液槽内装入最大体积150mL的菌液。对于TB培养基,虽然我们没有测试过,但是根据用户的反馈,将50mL菌液用50 mL培养液稀释后抽提的效果也很好。

你可以移出700µL TE,从而使最终的DNA浓度更高。我们不建议使用少于750 µL TE缓冲液洗脱。

仪器每次运行都要进行一次自我检测,每次大约需要6分钟。

你可以使用一个Hedland气压计测量气流速率。最低的标准是3立方英尺每分钟。气流速率没有上限。

你将需要一个室内的空气输出口(80–100 psi, 3 cfm, 稳定气流速率),或者一台相同规格的压缩机,用来连接到BenchPro® 2100质粒纯化工作站。

不能,该仪器使用正压工作,不能用负压工作。它使用室内空气管道工作,它是一条橙色的强制输出空气的管道。气压必须是80–100 psi。

BenchPro® 2100质粒纯化工作站可以同时处理一个或两个样本。

不能,BenchPro® 2100质粒纯化卡是不能重复使用的。在纯化过程中,E. Coli菌体被捕获在纯化卡内并裂解,所以纯化卡不能重复使用。

废液槽可以重复使用,并且它是由可以进行高压灭菌的材料制成的。你也可以订购新的废液槽。

不能。细胞内衬槽不能重复使用。它们需要在每次程序结束后丢弃。每个BenchPro® 2100试剂盒都提供相应的内衬槽和盖子。细胞内衬槽目前不能单独购买。

BenchPro® 2100质粒纯化卡和BenchPro® 2100试剂槽必须一直保存在原装盒子内以防止卡嘴或槽膜遭到破坏。保存温度应为室温。

是的,你可以使用空气压缩机。请联系技术支持团队获取推荐的型号。空气压缩机需要满足下列条件:

  • 常规压力输出在80到100 psi之间
  • 在80 psi测量时,常规压力输出流速>3 cfm
  • 常规输出气流露点温度<5°C

BenchPro® 2100仪器需要的人工设置时间小于5分钟。在设置完成后,仪器大约需要90分钟完成整个纯化过程。在纯化过程中你不需要守在旁边。

是的。如果你想得到更高浓度的质粒DNA,你可以在相应的试剂槽内减少洗脱缓冲液的体积。要减小洗脱缓冲液体积,可以使用移液器枪头刺破铝膜,然后移除相应体积的缓冲液。欲获得与此相关的特别指导,请联系技术支持服务。

该仪器可以纯化2.7到20 kb大小的质粒。

是的。使用100mL的LB培养液重悬细胞团块,然后将其加入细胞内衬槽。

平均而言,该仪器可以处理的生物量湿重是0.7到0.9 g。但是,根据所用细胞的不同大小和不同种属,这一指标会有差异。

该仪器纯化的质粒纯度很高,适用于所有下游应用,包括那些对纯度要求很高的应用,例如转染哺乳动物细胞,自动化或手动的DNA测序,PCR扩增,体外转录,细菌转化,克隆,以及标记。

你可以使用湿布擦拭BenchPro® 2100仪器表面。不要使用强力的试剂或溶剂清理仪器。清理仪器抽屉的底部时可以使用70%乙醇对其喷雾,然后用纸巾擦拭去除乙醇。

要获得最好结果,请参照下列指导:

  • 使用密度大约为109 cells/mL或600nm吸光度为2.0 至2.4的菌液。使用处于从对数生长期转向平台期的菌液。
  • 使用高拷贝质粒以获得高产量的质粒DNA。对于高拷贝质粒,每毫升过夜培养的LB菌液通常可以得到2–6 µg DNA。

我们不建议使用TB或高营养培养液。高细胞密度将堵塞滤膜而降低DNA产量。要获得最佳结果,请根据使用手册的指示进行纯化实验的设置。

是的。可以使用水替代1.5mL的TE缓冲液进行洗脱。小心地刺破装有TE的溶液槽并移除所有TE。用纯水润洗两次,然后向其内加入1.5mL纯水。

我们已经测试了DH10B-T1R, DH5α, JM109, TOP10, 及XL1-Blue,预想所有由上述菌种衍生出来的菌种都可以使用。注意:endA+菌种是可以使用的,但是在最终纯化得到的质粒内可能含有核酸酶活性。

不能。因为BAC克隆太大,所以该仪器不适合提纯BAC克隆。BenchPro®2100仪器能够纯化2.7至20 kb大小的质粒。

是的。你可以使用LB培养液或灭菌水重悬该细胞沉淀,使得其600 nm OD值为2.0。

只需使用一个USB设备,您就可以下载所有的软件更新。

下载软件更新后,将USB设备插入仪器后面的插槽内,然后根据屏幕上的说明进行操作。

不能,目前版本的 BenchPro® 2100不能和任何实验室信息管理系统进行联接。

不能,目前版本的软件不允许打断程序并继续运行。

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