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转化

请查看以下关于无菌落生成的可能原因和建议:

  • 检查所用的抗生素
  • 转化pUC19对照载体,检验感受态细胞。
  • 如果目的基因具有毒性,并且启动子为T7启动子,可尝试使用BL21 (DE3) (pLysS)或(pLysE)或BL21 (AI)感受态细胞。您也可尝试在培养基中加入葡萄糖。
  • 降低诱导温度至30°C、25°C或18°C,有助于增加溶解性和减少包涵体形成。温度越低,诱导所需时间越长(即,30°C需3-4小时,25°C需3-5小时,18°C需过夜)。
  • 在较高温度下生长(30°C或37°C)并达到合适的OD,加入诱导剂,然后降低温度。
  • 尝试不同剂量的IPTG(1 mM-0.1 mM IPTG)。
  • 使用低拷贝数的质粒。
  • 使用营养不丰富的培养基,例如以M9基本培养基代替LB。
  • 如果蛋白质需要辅因子,如金属,则在培养基中加入辅因子。
  • 增加葡萄糖至1%。
  • 尝试使用BL21-AI菌株并使用不同剂量的阿拉伯糖。

细菌蛋白质表达

请访问我们的克隆支持中心,获取关于限制性内切酶克隆Gateway克隆PCR (TOPO/blunt/等)克隆的信息。

请查看以下可能的原因和解决方案:

  • 载体中存在移码或提前终止密码子;应检查序列。
  • 使用了错误的菌株进行表达。
  • 使用甘油菌可能会改变质粒的完整性,因为大多数用于表达的菌株基因型不是RecA-和EndA-。应使用新鲜转化的细胞。
  • 蛋白质存在于不溶的组分中;应检查细胞裂解物,而不仅是上清液。
  • 目的基因使用了稀有密码子——检查所用密码子。
    (http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC)
  • 在培养过程中,细胞剔除了质粒——这在氨苄青霉素抗性质粒中较为常见。尝试在培养基中使用羧苄青霉素代替氨苄青霉素;接种前,使用含新鲜氨苄青霉素/羧苄青霉素的LB培养基清洗和重悬过夜培养物。

当您的目的基因具有毒性时这种情况很常见。尝试使用更严格调控的系统,如BL21 (DE3) (pLysS)或BL21 (DE3) (pLysE)或BL21(AI)。

使用新鲜的细菌培养物进行接种,因为新鲜的细菌菌落通常可得到较高的蛋白得率。

检查重组蛋白序列中的不常用密码子。利用常用密码子代替稀有密码子,可显著提高表达水平。例如,精氨酸密码子AGG和AGA是大肠杆菌的不常用的密码子,所以这些密码子的tRNA水平低。

进行蛋白纯化时,在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂,如PMSF。使用新鲜配制的PMSF,因为PMSF被稀释到水溶液中后30分钟内会失效。

如果您在表达实验中使用氨苄青霉素进行筛选,则可能会因为筛选条件缺失而出现质粒不稳定。这是因为氨苄青霉素被β-内酰胺酶破坏,或者在由细菌代谢物造成的酸性培养基条件下发生水解。在转化和表达实验中,可使用羧苄青霉素替代氨苄青霉素。

重组蛋白可能对细菌细胞具有毒性作用。应选择更严格调控的系统用于表达,如BL21-AI。也可考虑尝试使用不同的表达系统,如pBAD系统。

如果存在溶解性问题,可尝试在诱导时降低温度或减少IPTG用量。也可尝试使用不同的、更严格的菌株进行表达。此外,在表达期间,也可将细菌培养基的葡萄糖含量增加至1%。

通常,如果您看见1-2条主带,则表示密码子使用偏好导致了翻译过早终止。发生降解时,通常可看到梯度条带。发生降解时,可尝试在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂有助于防止降解。如果是这种情况,可通过时间点实验来确定收细胞的最佳时间。

有多种措施可防止由毒性基因本底水平表达带来的问题。这些方法均基于T7或Champion™表达质粒的设计和构建是正确的:

  • 在不含T7 RNA聚合酶(即,DH5α™)的菌株中繁殖和维持表达质粒。
  • 如果使用BL21 (DE3)菌株,应在室温而非37°C下生长24-48小时。
  • 新鲜转化严格调控的大肠杆菌菌株,如BL21-AI™菌株。
  • 转化实验后,将转化反应接种在含100 μg/mL氨苄青霉素和0.1%葡萄糖的LB板上。葡萄糖可抑制T7 RNA聚合酶的本底表达。
  • 完成BL21-AI™菌株的转化后,挑选3或4个转化株直接接种到新制备的含100 μg/mL 氨苄青霉素或50 μg/mL 羧苄青霉素(以及0.1%葡萄糖,如果需要的话)的LB培养基中。当培养物的OD600值达到0.4时,可加入终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖来诱导重组蛋白的表达。
  • 在表达实验中,在生长培养基中补充0.1%葡萄糖和0.2%阿拉伯糖。
  • 尝试使用调控型细菌表达系统,如我们的pBAD系统。

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