photograph of a microscope showing with a 10x objective in position and sample illumination light coming from below the stage.  

为您的成像靶标选择最合适的物镜

显微镜的物镜由一套复杂的镜片和光学元件组成,不同的目镜针对不同的成像目的而设计。能否捕获良好的图像,取决于物镜的选择是否正确。

您可以在本节学习到如何在实验中正确校正放大倍率,以及如何在空气、油或其他浸没介质之中使用物镜。


了解物镜

物镜是显微镜的基础组件,对成像质量有着很大的影响。物镜上写有很多信息,多数为代码的形式,但您也不必担心,这些内容破译起来并不困难。

Drawing of a typical microscope objective, with the objective type, magnification, correction collar, numerical aperture, immersion medium, and cover glass thickness labeled.

图 1. 物镜上常见的标识及其含义。


选择合适的放大倍数

放大倍数表示物镜提供的光学放大倍率

放大倍数表示物镜提供的光学放大倍率。具体选择哪一种放大倍数,取决于您希望观察的样本。放大倍数的使用情况也要受到分辨率的限制。将一大片模糊的光团放大,并不一定会使图片的清晰度更好。假定您在不同放大倍率下具有相似的分辨率,则提高放大倍率能让您观察到更微小的对象(例如细胞内的细胞器)。但另一方面,使用低放大倍率则能获得更清晰的大图 – 如细胞视野或细胞间相互作用。

Series of three photos of the same field of fluorescently stained cells, captured at 20x, 40x, and 60x magnification to show that higher magnifications can allow you to observe more detail in the sample.

图 2. 在不同放大倍数下捕获的细胞视野。每一放大倍数均可提供不同的信息,最适合的选择很大程度上依赖于您希望观察的内容。


为物镜选择合适的浸没介质

浸没介质是物镜和盖玻片(或者您盛放样品的培养皿或培养瓶底部)之间的物质。

每一种物镜都针对某一种浸没介质而设计(物镜上有所标注)。主要的浸没介质类型有空气、油和水。因此,您务必要注意,切勿将适用于空气的物镜放在油或其他液体之中。否则会令显微镜的管理人员发狂!之所以要使用不同类型的浸没介质,目的是为了最大限度降低物镜和样品之间的空隙内存在的折射率差异,这其中就包括放置样品的基底(例如,盖玻片)以及样品所处的成像介质。最大限度降低这种折射率差异,才能实现更好的图像分辨率。

Drawing showing how an objective used without immersion oil (left) is subject to interfering light more so than an objective in contact with immersion oil (right), because the refractive index of immersion oil is closer to that of the glass slide the sample is on.

图 3. 使用适合于物镜的浸没介质可以最大限度降低物镜和样品之间折射率差异。


折射率

光线通过不同类型的材料时,会存在不同的速率。当光线穿过某一种材料(例如空气)进入另一种材料(例如水)时,会出现折射。在此过程中,光线会有所弯曲。例如,当您将一根铅笔放入一玻璃杯水中时,从玻璃杯的另一侧观察,您会发现铅笔好像已经弯曲了。这是因为空气和水的折射率不同所致。


了解数值孔径和浸没介质的折射率

数值孔径是物镜的一种属性,用来指示您采集的图像可以实现的最高分辨率(基本上等同于您所能观察到的精细程度)。

很多时候,您会听到人们谈论物镜的NA。NA即表示数值孔径,其数值部分依赖于物镜和您的样品盖玻片之间的材料的折射率。通常情况下,NA越高,分辨率越高。NA越高的物镜通常放大倍率越高,并需要使用某些类型的浸没介质。浸没介质用来调整物镜和盖玻片之间的折射率,确保其接近玻璃盖玻片自身的折射率。这种处理可以最大限度降低折射,减少光线损失,最终获得更好的图像。

图 4. 由于玻璃和水的折射率不同于空气,铅笔看起来弯曲或折断了。

  Photograph of a pencil partially submerged in a glass of water. The pencil appears to be broken at the spot where it is no longer under water.


物镜相关的其他信息

是指为了实现不同类型相差提高分辨率,物镜中含有多少组矫正镜片。矫正镜片有助于校正光线穿过物镜时的光线弯曲路径等,以确保视野边缘和中间一样清晰;此外,在不同波长的光线穿过物镜内的镜片时,它们还可校正光线的不同行为。

样品通常封固在玻璃盖玻片上。最常见的的玻璃盖玻片名为#1.5盖玻片,厚度为0.17 mm。印在物镜上的盖玻片厚度数值表示物镜设计的最佳玻璃盖玻片(或任何您放置样品的基底,例如,塑料底器皿)厚度。

有些物镜具有较长的工作距离,这就表示该物镜可以在较大的盖玻片厚度范围内获得良好的图像。如果您希望透过塑料底器皿和T-75培养瓶等比玻璃底器皿更厚的器皿观察成像,这一类物镜较为适合。为获得最佳的成像效果,在制造长工作距离物镜内的镜片时,需考虑如何适应不同厚度的镜片。

有些物镜带有手动调节环。您可以将调节环转到与您的样品盖玻片厚度对应的特定数字,但并非所有的长工作距离物镜都有调节环。

The working distance is the distance between the objective and the cover glass, or between the objective and the top (or bottom) of whatever vessel you are imaging through, when your sample is in focus. When you are imaging through something thin, like a cover glass, you can use objectives with shorter working distances. But when you are imaging samples that are in a thicker vessel, such as a plastic plate or dish, you will probably need an objective that has a longer working distance. The working distance of an objective is often written on the objective. The working distance of the objective in this example is 7.4 mm. It is considered to have an ‘extra-long working distance’ and is abbreviated as ELWD on the objective.  

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