Physical Properties that Define Fluorescence

Fluorescence is a function of light energy

Fluorescent molecules by definition absorb light at one color (wavelength) and emit it at another. The difference in colors is called the Stokes shift. The cameras used in fluorescence microscopy allow the detection of signal beyond the wavelengths our eyes can see.

Learn about the physical properties that define fluorescence, including wavelength, how energy relates to fluorescence and fluorescent colors, and what defines a fluorescent molecule's spectra.

photograph of lightbulb  

荧光是一种光学能量的功能

根据自身的定义,荧光分子会吸收某一颜色(或波长)的光线并发射其他颜色(或波长)的光线。这种颜色上的差异被称为斯托克斯位移。荧光显微镜之中使用的照相机可以检测出波长超出我们肉眼可见范围的信号。

了解决定荧光性质的物理属性,包括波长、与荧光和荧光颜色有关的能量,以及决定荧光分子光谱的因素等。


可见光谱

在我们讨论显微镜中的光线时,通常会注明波长,尽管光量子(形成光线的能量团)同时以微粒和波动的形式存在。可见光或者说我们的肉眼能看见的光通常处于400–700 nm范围内,并且包含彩虹中的全部七种颜色(以约400 nm的蓝光开始,以约700 nm的红光结束)。

diagram showing the colors of visible light and how they fit into the electromagnetic spectrum

图1. 电磁光谱及其可见光波长及对应的颜色。


荧光显微镜的检测范围

diagram comparing light detection capabilities of the human eye with those of a CCD camera  

荧光成像的检测范围略微超出我们肉眼可见的范围。使用这一扩展范围的光线没有任何问题,因为在常规的荧光检测实验中采集样品发出光线的CCD照相机具有超出我们肉眼可见光范围的检测范围。实际上,细胞生物学成像波长范围通常介于300–800 nm之间。

图 2. CCD照相机与肉眼的光线检测范围和效率比较。


荧光是什么?

关于荧光这个术语有何特别之处?荧光指的是一种物体吸收特定波长的光线,然后再发射出其他波长的光线的物理性质。如果某种分子能够吸收某个波长的光线并发射另外一种波长的光线(即荧光),我们便将这种分子称为荧光团。通常情况下,该波长发射的光线能量都要低于其吸收的光线能量,因此简单来讲就是我们可以说,某些物体能够吸收蓝光发射出绿光,或者吸收绿光发射出红光。

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图 3. 可见光谱的能量与波长的反比关系。

  illustration showing how wavelength correlates to light energy and light color

 


illustration showing an electron's energy change as green fluorescence is emitted from blue incident light

图 4. 简化的贾布朗斯基图(Jablonski diagram),表明荧光团的电子在接收到荧光照射后,能量状态发生改变,同时光线的颜色也发生变化。

 

荧光信号的来源

为了更深层次地理解这一部分内容,我们需要思考一下构成光线的能量微粒——光量子。光量子所含的能量等级决定了光线的颜色、物理形态及其波长。当某一束光线(光量子)射中荧光团之后,能量被传递到荧光团的电子上,电子受到激发,但很快就会失去多余的能量,结果就导致这部分损失的能量以光线光量子的形式发射出去,但这时候发出的光量子能量就要比原来的光量子低,因此波长变长,光线变为另一种颜色。在成像实验中,这部分发射的光量子就是您需要作为数据采集的信号。


激发和发射光谱

大多数荧光团并不单单吸收某个离散波长的光线并发射另一离散波长的光线:它们通常吸收和发射某个波长范围内的光线。因此在我们考虑成像使用的荧光时,最好还要考虑到它们的完整吸收和发射光谱,同时留意其最大激发波长和最大发射波长。所谓的最大值,即激发光谱和发射光谱的峰值。

深入研究课程: 观看“荧光光谱揭秘”

graph showing the range of wavelengths that can be used to excite a given fluorophore and the resulting range of wavelengths of light that comprise the emission from that fluorophore, with peak wavelengths for excitation and emission marked

图 5. 细胞核染料(DAPI)的激发和发射光谱。图中显示了染料吸收的某个波长范围内的光线(激发,显示为紫色)以及染料发射某个波长范围内的光线(发射,显示为蓝色)。


至关重要的斯托克斯位移

指定荧光团的最大激发和发射光谱之间的差值被称为斯托克斯位移。相对于斯托克斯位移较小的荧光团,斯托克斯位移较大的荧光团更易于在成像实验中使用。当激发和发射光谱之间的差值很小时,很难从用于激发的光线中观察到标记对象上发射的光线,而且会存在更严重的背景荧光问题。

animated graph that shifts back and forth between the excitation and emission peaks of a fluorophore with large Stokes shift and one with a small Stokes shift

图 6. 相对于最大激发和发射光谱之间的间距较小的荧光团,间距较大的荧光团检测起来更可靠。将斯托克斯位移较大的荧光团(紫色和蓝色最大波长峰值)与斯托克斯位移较小的荧光团(橙色和红色波长峰值)相比较。


深入研究学习

Introduction to Fluorescence

This video provides an easy to understand overview of the basic principles of fluorescence and is suitable for beginners or for those that need a quick refresh.


Anatomy of Fluorescence Spectra

This video describes the principle behind fluorescence spectra and how they can be used to determine properties of a fluorescent molecule.

 

荧光简介

本视频以通俗易懂的方式对荧光的基本原理进行了概述,适于荧光初学者或者希望快速回顾荧光知识的人士。立即观看


 

荧光光谱揭秘

本视频介绍了荧光光谱的原理以及如何利用荧光光谱测定荧光分子的性质。 立即观看

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