疑难问题

看到了您不希望出现的荧光信号

背景荧光,有时也被称为噪声,是指在图像中观察到、但又不希望它出现的荧光信号。背景荧光有许多来源,但大体可归为两类。

背景荧光的来源

  1. 仪器设置和成像参数导致的背景荧光——如来自激发光源的光线、照像机的噪声和环境光线
  2. 样本、器皿、成像介质的自发荧光或没有与特异性靶标相结合的荧光染料所产生的背景荧光

来自仪器和光源的噪声或许难以确定和消除,但这类噪声通常比较恒定,不会随着时间的延长发生显著变化;而自发荧光和非特异性染色导致的背景荧光则更容易确定和纠正——至少理论上如此!毕竟实验设计导致背景荧光的形式可谓多种多样,您自然也可以采用多种方法予以抑制。在荧光成像实验中您可能会遇到的背景荧光光源包括:

  • 荧光染料:样本中未结合的染料或非特异性结合的染料
  • 样本本身可能具有自发荧光,进而导致背景荧光
  • 某些药物和诱导试剂具有(或被激发出)荧光特性
  • 用于细胞生长的器皿或基质也可能带来荧光
  • 成像过程中使用的培养基也可能成为背景荧光光源

diagram of a cell culture dish with the vessel, reagent, media, and sample labeled

图1. 实验中的背景荧光可能有多种来源

如何减少背景荧光

要想从荧光图像中获得最佳数据,您就要尽量扩大靶信号(目标荧光标记信号)与背景噪声(您不希望看到的荧光标记信号)之间的差异。在报告定量结果时,这一差异有时还会以比值的形式呈现:∆F/F,其中∆F=[信号-背景],F为背景。当然谁都希望使用非常明亮的荧光染料,但为了获得最佳结果,同时还要将背景或脱靶荧光控制在最低水平。降低背景通常有助于获得更高的成像对比度,从而更易于观察到所需信号。


由样本中未结合染料或非特异性结合染料而产生的背景荧光

  • 漂洗:当使用荧光或普通染料标记样本时,可以考虑使用PBS或同类缓冲盐溶液漂洗样本2到3次,这一操作能够去除未结合的荧光染料,从而有助于降低背景。
  • 优化荧光染料的浓度:利用荧光染料滴定法标记您的样本(见下图示例)。先分别使用低于、等于和高于推荐浓度的染料做对比试验,然后针对您的实验条件选择最佳的染料浓度,确保在获得明亮的特异性信号的同时,又能使多余的背景噪声最小化。

 

A four-panel image series showing how increasing dye concentration in a cell staining experiment can lead to increased background fluorescence.

图2. 同一实验条件下,不同染料浓度可产生截然不同的背景值。


尝试使用匹配不同检测通道的染料进行标记

如果您的样本存在自发荧光对信号造成干扰,不妨尝试使用匹配另一检测通道的染料进行标记(例如,从匹配绿色检测通道的染料切换至红色或远红外检测通道的染料)。


检测只含有细胞与药物/处理剂的反应孔中的荧光强度

检测只含有细胞与药物/处理剂(无荧光标记)的对照反应孔中的荧光强度以确定是否由于您的处理添加剂而导致活细胞成像过程中出现较高背景。如果真是如此,您便可以从结果中相应扣除此背景值;或者您也可以采用匹配另一不同(光学)通道的处理剂或染料。


检查使用的培养基

样本的培养基也可能会对您的结果造成影响。无论是固定样本成像还是活细胞成像,这种干扰都可能会发生。对于固定细胞成像——最常采用的是免疫标记技术——您可能需要检查封片剂;对于活细胞成像,通过使用光学透明的缓冲盐溶液取代完全培养基(包含蛋白质和维生素等会产生自发荧光的物质),将会获得更高的信噪比(参见活细胞成像部分)。


检查盛放样本的器皿

成像所使用的器皿也可能产生背景荧光。例如,经常用于细胞培养的塑料底培养皿会产生非常明亮的荧光,如果您碰到背景荧光过高的情况且当时使用的是塑料底器皿,可尝试换用玻璃底器皿。

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