The PSQ 96 system from Pyrosequencing™ is used to analyze large numbers of short to medium length DNA sequences.

This widely applicable sequencing technique (1) was developed at the Royal Institute of Technology (Stockholm, Sweden) and commercialized in 1999 by Pyrosequencing AB (now Biotage AB). 其专利技术的优势在于能够快速生成序列数据,且具有高准确度 (>99%) 和可重复性 (>99%)。 实时测序意味着无需标记引物、标记核苷酸或凝胶电泳。 The whole process from sample preparation to ready-analyzed results is completed in under 2 hours and is easily automated.

实时测序的原理

在单个试管中,利用酶级联系统检测不断延伸的DNA链的核苷酸组分 (图1)。 Four different enzymes are used - DNA polymerase, ATP sulfurylase, firefly luciferase and apyrase.

The single stranded DNA template is first hybridized with the sequencing primer and mixed with the enzymes along with the two substrates adenosine 5’phosphosulfate (APS) and luciferin. 然后将四种核苷酸之一 (dNTP) 加入反应。 如果核苷酸与模板链的碱基互补,则DNA聚合酶将其整合至延伸链。 焦磷酸盐(PPi)——摩尔浓度与加入的核苷酸浓度相同——释放,并在APS存在的条件下经硫酸化酶转化为ATP。

随后在ATP介导的情况下由荧光素酶将荧光素转化为氧化荧光素,利用在此过程中产生的可见光的量进行检测。 未结合的核苷酸被三磷酸腺苷双磷酸酶降解,随后继续向管中加入核苷酸,重复上述级联反应。 Pyrogram™ (图2) 检测光信号,每个峰代表加入到DNA延伸链中的一种或更多的相同碱基。

制备单链DNA模板

Pyrosequencing™需要一个单链测序模板。 制备该模板的最简单方法是使用Dynabeads M-280链霉亲和素 (图3)。 首先利用生物素标记的引物对目的DNA片段进行PCR扩增。 The amplicons are then immobilized onto the beads and the non-biotinylated strand denatured with NaOH. 对DNA链进行洗脱和冲洗,去除其他所有反应组分后,加入测序引物并退火形成纯的单链DNA模板。 (Large volume discounts are available, please inquire.)

使用专门设计可容纳96孔板的磁体,可同时完成至多96个样本的手动样本制备。 Alternatively, protocols for automated sample preparation with Dynabeads M-280 Streptavidin have been developed with first-class results on the Tecan Genesis Workstation 150 using the Tecan MagS station (TECAN AG, Switzerland) (Figure 2 and Figure 4), and on the Magnatrix 1200 workstation (Magnetic Biosolutions AB, Sweden).

焦磷酸测序级联系统图示
图1. Pyrosequencing™级联系统
热解谱图
图2. 加入核苷酸产生Pyrogram™

单链模板图示
图3. Single-stranded template preparation

自动和手动生成的模板热解谱图
图4. Pyrograms produced with automated (above) and manual (below) template preparation for Pyrosequencing™ SNPs Analysis

实时测序的应用

Pyrosequencing™首先应用于各个研究领域的SNP分析 (3)。 随后开始应用于其他各种应用领域。

使用Pyrosequencing™实时测序技术可以快速获得短至中等长度的DNA序列 (一般为20-30碱基),适用于疾病相关突变的鉴定 (4) 和基因组多样性分析 (5)。 感染性物质的基因分型是利用该技术进行序列分析的另一个应用领域。

最近有报道称,利用该技术已成功完成人乳头瘤病毒 (6) 和幽门螺杆菌 (7) 的分型。 在疾病治疗领域,采用Pyrosequencing™技术可以检测HIV-1蛋白酶抑制剂的抗性,从而对药物治疗进行监测 (8)。

参考文献

  1. Ronaghi M, Uhlén M和Nyrén P. 基于实时焦磷酸盐含量的测序方法。 Science 1998;281:363-365.
  2. Blomgren P et al. 用于焦磷酸测序的手动和自动样本制备。 Pyrosequencing AB海报。
  3. Alderborn A, Kristofferson A和Hammerling U. 利用实时焦磷酸盐DNA测序测定单核苷酸多态性。 Genome Res. 2000;10(8):1249-1258.
  4. Ahmadian A et al. 利用焦磷酸测序分析p53肿瘤抑制基因。 Biotechniques 2000;28(1):140-144.
  5. Schiller AL et al. 利用焦磷酸测序实现等位基因频率的准确估算。 Pyrosequencing AB海报。
  6. Gharizadeh B et al. 利用焦磷酸测序实现人乳头瘤病毒分型。 Lab. Invest. 2001;81(5):673-679.
  7. Monstein H, Nikpour-Badr S和Jonasson J. 利用16S rDNA可变V1和V3区域的焦磷酸测序实现幽门螺杆菌的快速分子鉴定和亚型分型。 FEMS Microbiol. Lett. 2001;199(1):103-107.
  8. O’Meara D et al. 利用焦磷酸测序监测人免疫缺陷病毒1蛋白酶抑制剂的抗性。 J. Clin. Microbiol. 2001;39(2):464-473.


图1, 2和4来自于Pyrosequencing AB。Pyrosequencing™和Pyrogram™是瑞典乌普萨拉Pyrosequencing AB的商标。
如需进一步了解有关Pyrosequencing™技术及应用的信息,请联系Pyrosequencing AB或登录公司网站www.pyrosequencing.com