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筛选

我们大部分大肠杆菌菌株是源于K12菌株,因此被认为对于人或者动物是非致病性的。例外的情况包括BL21菌株(源于大肠杆菌B,这一菌株也被认为是非致病性的)、Mach1™(源于大肠杆菌W)及HB101。HB101源于K12/大肠杆菌B的杂交株。非致病性声明

盖子颜色/菌株对应表

菌株 类型 储存管大小 盖子颜色
化学感受态 单次
TOP10 单次 2.0ml 紫色
TOP10F’ 单次 2.0ml 蓝色
INVαF’ 单次 2.0ml 透明
TOP10/P3 单次 2.0ml 橙色
BL21(DE3)pLysS 单次 2.0ml 绿色
BL21(DE3)pLysE 单次 2.0ml 粉色
INV110 单次 2.0ml 红色
ME DH5αT1 单次 2.0ml 黄色
ME DH10B T1 单次 2.0ml 绿色
MachT1 单次 2.0ml 蓝色
PIR1 单次 2.0ml 黄色
PIR2 单次 2.0ml 黄色
BL21 (DE3) 单次 2.0ml 褐色
BL21 Star (DE3) 单次 2.0ml 红色
BL21 Star (DE3)pLysS 单次 2.0ml 蓝色
BL21-AI 单次 2.0ml 橙色
Stbl3™ 单次 2.0ml 透明
化学感受态 每管反应数
ME DH5αF’IQ 多次反应 2.0ml 绿色
ME DH10B 多次反应 2.0ml 红色
LE DH5α™ 多次反应 2.0ml 蓝色
SE DH5α™ 多次反应 2.0ml 透明
ME DH10Bac 多次反应 2.0ml 蓝色
ME Stbl2™ 多次反应 2.0ml 绿色
ME DH5α™ 多次反应 2.0ml 褐色
电转化感受态
TOP10 单次 1.5ml 黄色
Electrocomp – MultiRxn
Top10 多次反应 1.5ml 黄色
Top10F’ 多次反应 1.5ml 绿色
GeneHogs 多次反应 1.5ml 蓝色
MC1061/P3 多次反应 1.5ml 红色
HB101 多次反应 1.5ml 粉色
EM DH5α-E 多次反应 1.5ml 红色
EM DH10BT1 R 多次反应 1.5ml 橙色
EM DH10B 多次反应 1.5ml 黄色
EM Stbl4™ 多次反应 1.5ml 透明

ME =最高效率,SE =亚克隆效率, LE =文库效率

我们的Mach1™-T1R感受态细胞比我们其它常规克隆菌株长得快。它的倍增时间是54分钟,而普通的克隆菌株如DH5α™的倍增时间则需要增加70分钟。37摄氏度下将转化混合液铺板后8小时左右就可以在培养板上看到Mach1™-T1R菌株的克隆。将过夜培养的单个大克隆接种到1.5毫升离心管37摄氏度下培养4小时就能进行质粒小抽。

文库转化优选OmniMAX™ 2菌株,因为它具有转化效率高并且与基因组克隆相兼容的特点。

是的,我们的INV110菌株就是dcm/dam–型的。

下表比较了Stbl2™和Stbl4™感受态细胞的菌株特点。

  Stbl2™ Stbl4™
基因型 gal+, lon-, lac- gal-, lon+, f80lacZDM15
蓝白斑筛选 不能
F’ 不能
抗生素抗性 TetS TetR
转化能力 化学转化感受态, >1 x 10e9 ElectroMAX™ 电转感受态 >5 x 10e9
包装形式 5 x 0.2 mL 5 x 0.1 mL

我们推荐使用mcr/mrr–菌株,这种菌株可以防止甲基化的真核DNA在大肠杆菌宿主中的扩增受到限制。我们还推荐使用T1R菌株,因为T1是基因组/cDNA文库中一种常见的污染。

DH5α™细胞是常规克隆的常用菌株,但它是mcr/mrr+的,因此不推荐用于基因组克隆。另一方面,TOP10感受态细胞包含突变的mcr/mrr,因此是常规克隆不错的选择而且可以用于甲基化的DNA的克隆,如真核基因组DNA。我们的Mach1™菌株是生长最迅速的具有T1噬菌体抗性的菌株。

我们推荐使用Stbl3™感受态细胞,因为它们已经经过测试可以用于克隆含有直接重复序列的不稳定慢病毒DNA。

有少数例外,但他们主要的区别在于所保证的转化效率:

Subcloning Efficiency™细胞每转化1 µg pUC19或pUC18超螺旋质粒保证产生至少1.0 x 10E6个转化子。

Library Efficiency™细胞每转化1 µg pUC19或pUC18 DNA保证产生至少1.0 x 10E8个转化子。

MAX Efficiency™细胞每转化1 µg pUC19或pUC18 DNA保证产生至少1.0 x 10E9个转化子。

Efficiencies of Invitrogen E. Coli host strains

Invitrogen E. Coli 宿主菌株转化效率。

我们推荐使用ElectroMAX™ DH12S™细胞(货号 18312-017)。它们是endA+的电转感受态细胞,可以用于制备单链DNA。

是的,我们推荐使用我们的MAX Efficiency DH10Bac™感受态细胞。DH10Bac™大肠杆菌菌株包含杆粒,它可以与我们的供体质粒pFastBac结合使用,产生一个表达杆粒。这些细胞属于我们的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的一部分。

TOP10与TOP10F’细胞的区别仅在于后者包含F’游离体因而带有四环素抗性基因,而且能够从带有f1复制起点的载体菌株中分离单链DNA。F’ 游离体同时还带有lacIq抑制子,因此可用IPTG诱导trc、ta、和lac启动子的表达。TOP10F’细胞需要IPTG诱导进行蓝白斑筛选。

含F质粒的菌株,如TOP10F’,不推荐用于转化和筛选任何含ccdB基因的TOPO载体的重组克隆。F质粒编码CcdA蛋白,该蛋白是CcdB旋转酶-毒素蛋白的抑制剂,但是CcdA蛋白的半衰期比CcdB蛋白短。当没有足够的CcdA抑制CcdB蛋白时,过表达CcdB蛋白会引起细胞死亡。

转化

下面是一些能帮助您获得最高转化效率的建议:

  • 将感受态细胞在冰浴中解冻而不是在室温中解冻;不要对细胞进行涡旋震荡。
  • 感受态细胞解冻后,立刻在其中加入DNA。
  • 确保孵育时间是符合感受态细胞实验方案中针对该菌种所列出的要求的;改变孵育时间会降低效率。
  • 去除您的DNA样本中的盐分及其它污染;转化前可以使用离心柱或苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀的方法纯化DNA。

感受态细胞效率通过测定转化效率得到。转化效率等于每µg质粒DNA形成的转化子的数量,或者克隆数量(cfu/ µg)。

在平板上,我们建议50 µg/mL X-gal和1 mM IPTG (0.24 mg/mL)。当直接涂布到琼脂平板上时,我们建议在琼脂平板表面使用40–50 µl溶于DMF的40 mg/mL 的X-gal (2% 储液)和30–40 µl的100 mM IPTG。让X-gal和IPTG向琼脂内进行扩散大约1小时。不要在含有葡萄糖的培养基上涂布,因为葡萄糖会和X-gal或bluo-gal竞争从而阻止细胞变蓝。

是的,这是可以的。我们推荐使用饱和量的DNA(每种质粒10 ng)。确保不同质粒的复制起始点不同,以便它们可以同时存在于细胞中。如果复制起始点相同,则两种质粒会互相竞争,其中一种质粒即使稍有劣势也可能会丢失。另外,带有一个质粒的细胞可以通过电转导入第二个质粒,而不会破坏已有质粒。

对于长期存储,建议制作甘油存储液并保存在-70摄氏度。请按以下步骤操作:

  1. 挑取1个克隆到5 mL的LB培液或SOC培液中。37摄氏度培养过夜。
  2. 制备甘油溶液:6 mL的SOB培液加4 mL甘油。
  3. 细胞与甘油溶液等体积混合并混匀。
  4. 在乙醇/干冰混合物中冷冻然后存储在-70摄氏度。

SOB培液(每升)

组分 最终浓度
蛋白胨(SELECT Peptone 140) 20 g 2%
酵母提取物(SELECT Yeast Extract) 5 g 0.5%
1 M NaCl 10 mL 10 mM
1 M KCl 2.5 mL 2.5 mM
1 M MgCl2 (使用MgCl2/6H2O制备,过滤灭菌) 10 mL 10 mM
1 M MgSO4 (使用 MgSO4/7H2O制备,过滤灭菌) 10 mL 10 mM
蒸馏水 加至终体积1L
步骤:加入蛋白胨,酵母提取物,NaCl, 以及 KCl 至980 mL蒸馏水中。搅拌溶解,高压灭菌,然后冷却至室温。1 M镁溶液各加10ml。
我们建议使用一台提供16 kV/cm电压并且在用户手册中分别列出了针对各种电转感受态细胞转化条件的仪器。

请参考以下对dam和dcm甲基化敏感的限制性内切酶列表:

  • Dam: Bcl I, Cla I, Hph I, Mbo I, Mbo II, Taq I, Xba I, BspH I, Nde II, Nru I
  • Dcm: Ava II, EcoO 109 I, EcoR II, Sau96 I, ScrF, Stu I, Aat I, Apa I, Bal I, Kpn I, ISfi I
  1. 使用pUC或基于pUC的载体,这些载体含有lacZ基因的一部分,可以进行α补偿。
  2. 选择一种带有 lacZdeltaM15标记的E. Coli菌株。
  3. 将转化混合液涂布在含有X-gal的平板上。在一个100 mm平板上涂布50 µg的2% X-gal或者100微升2% bluo-gal (均可溶解于DMF或50:50的DMSO:水混合物中)并晾干。此外,也可在倒板前直接向冷却后的培液中加入终浓度50 µg/mL的X-gal或300 µg/mL的bluo-gal。平板在4摄氏度可稳定保存4周。
  4. 如果菌株带有lacIq标志,则需加入IPTG以诱导lac启动子。在100 mm平板上涂布30 µl的100 mM IPTG(溶于水中)。此外,也可以在倒板前直接向冷却后(大约59度)的培养液中加入IPTG至终浓度1 mM。平板在4摄氏度可稳定保存4周。
  5. 如果要使用 X-gal或bluo-gal进行蓝白斑筛选,那么不要将E. coli 涂布在含有葡萄糖的培养基上。因为葡萄糖会作为底物和X-gal或bluo-gal竞争从而阻止细胞变蓝。

您将需要细菌生长培养基,例如LB,细菌筛选用的抗生素,以及诱导剂(IPTG, X-gal)。我们提供用于培养E. Coli菌株的imMedia™生长培养基,它是一种预混的、预先灭菌的培养基,包含筛选用抗生素。制备过程中可以加入或者不加入IPTG和X-gal。

形式

我们推荐将感受态细胞存储在-80摄氏度。高于这个温度,即使存储时间很短,也会显著降低其转化效率。
我们的所有感受态细胞的制作程序和相关配方都是保密的。所有化学感受态细胞都是保存在一种含有盐混合物及一种冻存稳定剂(比如甘油或DMSO)的水溶液中的。
请查看您产品对应的分析证书。通常,所有感受态细胞都使用pUC19超螺旋质粒在不饱和条件(每个反应10–500 pg,不同产品可能不同)下进行转化效率测试。细胞还经过氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、链霉素、Zeocin和壮观霉素抗性筛选,以及无噬菌体污染的筛选。一些产品还根据其应用要求经过了其它额外的筛选检测。这些测试可能包括使用另一种特定载体测试转化效率(如使用pDONR转化ccdB Survival™ 2T1R抗性细胞),营养缺陷型标记筛选,代谢标记筛选,噬菌体抗性筛选,等等。
我们不建议将感受态细胞保存在液氮中,因为极端温度会损害细胞。另外,装感受态细胞的塑料管子可能承受不了如此低的温度,从而发生破裂。

极端pH值和/或者高离子强度会抑制Zeocin™抗生素的活性。为获得理想的Zeocin™抗生素筛选活性,E. coli生长培养基中的盐浓度必须低于 110 mM 并且pH值必须为7.5。特别注意的是,进行Zeocin™抗性筛选时应该使用低盐LB配方(每升含5 g或更少的NaCl)。

另外,任何包含完整Tn5转座元件的E. Coli菌株(比如DH5αF'IQ™, SURE, SURE2)都编码ble (bleomycin)抗性基因。这些菌株具有Zeocin™抗生素抗性。为了用Zeocin™抗生素进行最有效的筛选,请使用不含Tn5基因的E. Coli菌株(比如TOP10, DH5a™, DH10B™等)。

One Shot形式采用预分装的单管形式提供,每管足够一次反应使用。使用One Shot细胞可以避免反复冻融和额外的移液步骤。Standard形式的感受态每管足够两次或更多次反应使用,采用常规用途试剂盒形式提供,可满足需要同时进行多个转化的科学家的要求。MultiShot™试剂盒适用于高通量转化实验,以聚碳酸酯薄壁96孔板的形式提供。