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RNAi概述

RNAi代表RNA干扰。介导RNAi的分子是经过内源Dicer酶剪切的短双链RNA(dsRNA)寡核苷酸。Dicer酶的剪切产物一开始被叫做短干扰RNA,现在被称为siRNA。RNAi技术利用细胞的天然机制,通过转染siRNA而有效敲低特定基因的表达。诱导RNAi有几条途径:合成的分子,RNAi载体,以及体外剪切。在哺乳动物细胞中,短dsRNA——短干扰RNA——启动对细胞内目标mRNA的特异性降解。在这一过程中,siRNA的反义链成为一个多蛋白复合体或RNA诱导的沉默复合体(RISC)的一部分,该复合体随后找到相应的mRNA并在特异性位点将其剪切。然后,该剪切后的信使RNA被特异性降解,并最终导致蛋白表达的敲低。

siRNA代表“短干扰RNA”。它包含两条互补的19-21碱基的RNA链,并带有TT或dTdT突出末端。更长的dsRNA将触发增强的免疫反应而被降解。突出的末端被认为是在Dicer酶剪切过程中添加的。目标分子的剪切被认为是发生在反义链的中间部位,所以中间位置的碱基需要是保守的。合成的dsRNA分子将通过电转或脂质体转染进入细胞内引发RNAi作用。一旦进入细胞,siRNA的两条链将分开,释放出反义链。反义链在RISC蛋白的辅助下结合到与其互补的mRNA分子上。如果碱基完全配对,则mRNA分子将被降解。

反义链(引导链)将与mRNA结合。

根据您所靶向的基因,在转染后数小时即可在mRNA水平检测。我们建议在转染48小时后检测mRNA的敲低水平。影响检测时间的因素包括转录活性,信使RNA的降解速度,以及是否存在替代通路。要确定敲低的峰值,最好进行一个时间梯度实验。

请访问我们的转染支持中心查找有关转染的技术资源、建议和诀窍,以及问题排查信息。

是的,如果经过反复转染步骤细胞状态没问题即可。

我们建议使用以下对照:

  • 阳性对照siRNA
  • 阴性对照siRNA
  • 仅有细胞(无siRNA)的对照
  • 针对靶基因的多条siRNA
  • 仅有转染试剂(无siRNA)的对照

请查看下列信息:

(a) Silencer Select: “ThermoFisher Scientific向您担保,如果您针对同一靶基因购买了两条预设计的Silcencer SelectsiRNA,这两条siRNA均能够达到对靶基因的70%或以上的敲低效果。此担保的前提条件是,siRNA的转染浓度必须在≥5 nM,且在转染后48小时测定mRNA水平。建议采用实时定量RT-PCR技术检测mRNA水平,但不做强制性要求。客户还必须提供阳性对照的有效敲低结果,从而证明转染效率是足够的。如果未能检测到我们承诺的敲低水平,而阳性对照的结果是成功的,我们将会免费为您合成一条新的Silencer Select siRNA。此担保不适用于任何换货产品。”

(b)
Stealth siRNA: “ThermoFisher Scientifics向您担保,如果您针对同一靶基因购买了三条预设计的Stealth siRNA,这三条独立的非重叠的siRNA之中至少有两条能够对靶基因mRNA的敲低效果达到70%或以上。此担保的前提条件是,siRNA转染的终浓度必须≥20 nM,且在转染后48小时测定mRNA水平。建议采用实时定量RT-PCR技术检测mRNA水平,但并不是强制的。客户还必须证明采用阳性对照siRNA能够充分敲低,从而证明转染效率是足够的。如果未能观测到我们担保的敲低水平,而适当的阳性对照成功敲低,我们将会免费为您合成一条新的StealthsiRNA序列。此担保未延伸至任何换货产品。我们还建议您使用适当的阴性对照(如三种Stealth™ RNAi阴性对照之中的一种)来标准化mRNA的敲低水平。”

(c) Silencer: “ThermoFisher Scientific向您担保,如果您购买了针对同一靶基因的三条预设计的Silencer siRNA,其中至少有两条能够将培养细胞内的靶标mRNA的表达水平降低70%或以上(在100 nM或更高的siRNA终浓度下进行转染,转染后48小时后测定,试验条件如下所述)。如果三条之中至少有两条未能引起>70%的靶标mRNA敲低效果,ThermoFisher Scientific将会免费一次性更换至多三条预设计的SilencersiRNA。产品更换申请必须在预设计SilencersiRNA发货后一百八十(180)天内提出。您必须遵照良好的实验室操作,而且靶向内源基因的经验证的siRNA(例如,Ambion Silencer GAPDH siRNA对照)对照实验结果确认转染效率最佳。为了评估敲低效果,预处理样品内的靶标mRNA水平必须与采用非靶向对照siRNA(例如Silencer阴性对照1)转染的细胞内的靶标mRNA水平进行比较。我们建议采用TaqMan®基因表达检测试剂盒定量mRNA水平。”

纯化方法的选择取决于您的实验。请参考下列通用指南:

标准纯化:

  • 脱盐并使用MALDI-TOF质谱分析
  • 保证至少80%为全长产品
  • 推荐用于贴壁细胞系

HPLC:

  • HPLC纯化并使用MALDI-TOF和分析级HPLC分析
  • 保证至少97%为全长产品
  • 推荐用于电转原代或悬浮细胞系

体内级别纯化方式

  • HPLC纯化,使用MALDI-TOF和分析级HPLC分析,透析脱盐,过滤除菌,并经过内毒素测试
  • 保证至少97%为全长产品
  • 适用于使用siRNA进行动物体内实验的研究者

请注意,在所有情况中,退火效率均使用PAGE分析。

是的,我们提供几种可选的阴性和阳性对照。阴性对照通常是通用的非靶向序列,而阳性对照是可用作阳性对照和/或方法验证的报告基因的siRNA。请选择和您的siRNA带有同样修饰的对照(如Silencer® Select阴性对照,Stealth阴性对照)。

阴性对照是为了反映siRNA对细胞的效果不是由序列的非特异性引起的。阴性对照应该和您的阳性分子的化学特征(长度、修饰)相匹配,但应该是一条不靶向任何特定基因的非靶向型序列。

是的,我们提供pSCREEN-iT™/lacZ-DEST Gateway®载体试剂盒,它可以用于进行任何RNAi敲低效果的评估,无需知道蛋白功能,无需进行免疫印迹或qRT-PCR。该系统使用β半乳糖苷酶活性检测来测定RNAi试剂(Stealth siRNA,Silencer® siRNA,shRNA质粒,Dicerpools等)的基因敲低效果。将您的目标基因克隆到试剂盒提供的载体上,然后将其和所测试的RNAi试剂共转染。表达的基因产物将和β半乳糖苷酶融合,从而可以根据β-Gal水平来测定RNAi介导的目的基因的mRNA降解水平。

通常,我们建议将品牌匹配实验和对照用的siRNA。Silencer®,Stealth和Silencer® Select siRNA在长度和修饰方面有一些不同。好的实验设计应该使实验和对照siRNA之间的差异最小化。虽然如此,在没有其他选择的情况下,使用和实验siRNA不同种类的阴性对照仍然可以起到排除脱靶效应的对照作用。

可以,siRNA文库可以以96孔板或384孔板形式订购。siRNA文库可以靶向任意数量的基因,例如,整个基因组,一个基因家族,一个生物学通路,或是定制的一组基因。请将您的需求发送至RNAilibraries@lifetech.com

脱靶效应是指由siRNA通过RNAi机制引起的任何非靶基因的沉默。这种效应既可以来自于siRNA引导链(反义链)也可以来自于传递链(正义链)。

定制设计:如果不存在预设计的siRNA,那么我们会用自己的算法根据目的基因的序列或数据库编号(accession number)(靶向转录变异体,非人、小鼠或大鼠的物种)设计一个siRNA。定制设计的siRNA是不适用质量保证条款的。

定制合成:用户提供siRNA序列,我们合成。定制合成的siRNA不适用于质量保证条款。

定制修饰:用户可以提出定制修饰,例如加入荧光标记(FAM®, Cy®3),定制规格(>50 nmol)或分装的报价咨询。定制修饰的siRNA不适用于质量保证条款。

RNAi是一种快速鉴定基因功能的经济有效的方法,并且对于目前测试过的大多数基因都有效。RNAi正在迅速成为敲低目的基因表达的首选方法。RNAi对于研究基因功能,信号通路分析,RNAi机制研究,靶点验证均非常有用,并且显示出巨大的诊断和治疗应用潜力。

生成siRNA并导入哺乳动物细胞的三种最常用的方法如下:

  • 体外转录和剪切
  • 合成siRNA
  • 携带RNAi元件的载体

两者的分子结构是相同的:Dicer将长dsRNA特异性剪切为21–23个核苷酸的双链,同时带有siRNA标志性的2碱基突起。两者一个重要的区别是d-siRNA通常包含一组从目的dsRNA全长生成的siRNA,而siRNA通常是指靶向特定目的区域的一个单一序列,并且经常以一个单一寡核苷酸序列或几个寡核苷酸的特定组合的形式被合成。

最常用的测定特异性基因敲低的方法是进行实时PCR。在某些情况下,可以使用报告基因系统方便地测定报告基因如β半乳糖苷酶的表达。也可以使用免疫印迹分析比较导入siRNA之前和之后的蛋白表达。

要分析一个特定siRNA序列对基因活性的影响,所导入的siRNA的序列必须是已知的。这就要求在加入合成的siRNA或者携带短发夹RNA(shRNA)的载体之后设计、引入并测定基因的封闭效果。当剪切后的siRNA(d-siRNA)被导入细胞后,它们对于引发RNAi效应尤其有效,因为在这一组序列中通常会有数个有效siRNA序列。但是,目前没有方法得知这一效应是由这组序列中哪个(或哪些)特定序列引起的。

Silencer® and Silencer® Select siRNAs

Silencer® siRNA是我们的第一代siRNA,而Silencer® Select siRNA是我们的第二代Ambion® siRNA。两者使用不同的算法进行设计,但是都包含一个19核甘酸的核心序列和一个2碱基的3’突起。Silencer® Select siRNA还包含一种化学修饰。我们建议尽可能使用Silencer® Select siRNA,因为它们的效率、特异性,以及基因敲低能力都更好。

该修饰是LNA™——锁核苷酸修饰——它可以提高与互补RNA形成的双链的热稳定性和特异性。该修饰的位置是受专利保护的。

预设计的Silencer® siRNA是使用算法设计的,没有经过功能测试。它们靶向于人、小鼠和大鼠基因,并且设计为靶向所有已知剪接变异体。一旦这些siRNA被购买,我们将提供它们的序列信息。我们保证靶向同一目的基因的3个Silencer®siRNA中的2个或2个Silencer® Select siRNA的2个可以达到大于70%的基因敲低效果。经验证的siRNA是使用算法设计并经过实验验证其mRNA敲低效果大于70%。它们每一个都保证具有基因沉默效果,对于一些人的基因,有验证过的siRNA。验证信息是可以提供的,一经购买,序列信息也可提供。

是的,可以定制21碱基序列的siRNA,可以选择带有或不带有Silencer® Select修饰。更长或更短的siRNA,请电邮oligos@ambion.com咨询。

Silencer® Select siRNA的平均分子量是13,400 g/mol,1nmol = 13.4 µg。

是的,我们有针对整个人类基因组以及不同功能基因家族的预制板形式的Silencer® Select 文库。我们还提供定制Silencer® Select siRNA文库以及靶向人和小鼠的定制Silencer® 文库

是的,我们的Silencer® Select siRNA可以设计用于靶向敲低人、小鼠和大鼠细胞质或细胞核内的长链非编码RNA(>100nt)。现有的有预设计siRNA的ncRNA和目前Thermo Fisher Scientific提供的TaqMan®非编码RNAassay高度匹配。

一旦选择HPLC作为纯化方法或提出询价,我们对于预设计/经验证的,以及定制合成的Silencer® siRNA均提供Cy®3和FAM®标记的Silencer® siRNA。

是的,大多数Silencer® Select siRNA在正义链末端带有dTdT突起。重要的是反义链(引导链)的3’末端突起会和目的mRNA的5’末端互补,因此,这些末端突起可以由任意不同的核苷酸组成。

我们建议至少使用2个靶向同一基因的siRNA。这将为RNAi数据带来更高可信度。

不能,Silencer® Select siRNA订购时不能带有荧光标记。虽未被验证,Silencer® Select siRNA应该可以用Silencer® 标记试剂盒(货号AM1632和AM1634)有效标记。

对于Silencer®和Silencer® Select siRNA我们均提供多个阴性和阳性对照。

Silencer® siRNA阳性对照有:

Silencer® Firefly Luciferase (GL2 + GL3) siRNA(货号AM4629, 5nmol)

Silencer® GAPDH siRNA(人)(货号AM4605, 5nmol; AM4633, 40 nmol)

Silencer® GAPDH siRNA (人,小鼠,大鼠) (货号AM4624, 5 nmol; AM4631, 40 nmol; AM4632, 5 x 40 nmol)

Silencer® GFP (eGFP) siRNA (货号AM4626, 5 nmol)

- Silencer® KIF11 (Eg5) siRNA (人,小鼠,大鼠) (货号AM4639, 5 nmol)

如果使用荧光标记的Silencer® siRNA,我们有:

Silencer® Cy™-3标记GAPDH siRNA (人,小鼠,大鼠) (货号AM4649, 5 nmol)

Silencer® FAM®-标记GAPDH siRNA(人,小鼠,大鼠) (货号AM4650, 5 nmol)

如果使用体内级别的Silencer® siRNA,可以选:

Silencer® GAPDH阳性对照siRNA,in vivo ready(货号4404025, 250 nmol)

 

Silencer® siRNA阴性对照有:

Silencer®阴性对照1号 siRNA(货号AM4611, 5 nmol; AM4635, 40 nmol; AM4636, 5 x 40 nmol)

Silencer®阴性对照2号siRNA(货号AM4613, 5 nmol; AM4637, 30 nmol)

Silencer®阴性对照3号 siRNA(货号AM4615, 5 nmol)

Silencer®阴性对照4号 siRNA(货号AM4641, 5 nmol)

Silencer®阴性对照5号 siRNA(货号AM4642, 5 nmol)

如果使用荧光标记的Silencer® siRNA,我们有:

Silencer®Cy™ 3-标记阴性对照1号siRNA(货号AM4621, 5 nmol)

Silencer® FAM®-标记阴性对照1号 siRNA(货号AM4620, 5 nmol)

如果使用体内级别的Silencer® siRNA,可以选:

Silencer® 阴性对照 1号 siRNA(货号4404021)

 

Silencer® Select siRNA阳性对照有:

-  Silencer® Select GAPDH阳性对照siRNA(货号4390849, 5 nmol; 4390850, 40 nmol; 4404024, 250 nmol)

-  Silencer® Select MALAT1阳性对照siRNA,靶向非编码siRNA (货号4455877, 5 nmol)

如果使用体内级别的Silencer® Select siRNA,可以选:

Silencer® Select GAPDH in vivo(货号44404024)

 

Silencer® Select siRNA阴性对照有:

-  Silencer® Select阴性对照1号 siRNA (货号4390843, 5 nmol; 4390844, 40 nmol)

Silencer® Select阴性对照2号 siRNA (货号4390846, 5 nmol; 4390847, 40 nmol)

如果使用体内级别的Silencer® Select siRNA,可以选:

Silencer® Select阴性对照1号 siRNA, 体内级别 (货号4404020, 250nmol)

阳性对照siRNA例如Silencer® Select GAPDH siRNA将证明转染的有效性并有助于优化转染条件。阴性对照siRNA对于设定基因表达的基线是必要的。请点击这里阅读更多关于对照实验的信息。

我们有靶向MALAT-1的阳性对照siRNA(货号4455877),MALAT-1是一个主要位于细胞核内的非编码RNA。Silencer® Select阴性对照1和2可以作为阴性对照。

可以使用实时PCR检测mRNA水平。通常在转染后24, 48和72小时做一个时间曲线分析。蛋白水平可以在48, 72和96小时后检测。检测时间根据目的基因的不同会有差异。

仅需要使用一个阴性对照siRNA即可。我们提供两个不同阴性对照序列是为了应对罕见情况下其中一个序列可能出现的脱靶效应。

Stealth and Stealth Select siRNA™

Stealth RNAi™是一条25-mer的平末端dsRNA寡核苷酸,包含一个化学修饰的正义链。该化学修饰是专利保护的,它可以有助于:

-         提高RISC复合物的稳定性

-        提高体外稳定性

-        降低正义链的脱靶效应,因为它不再会被用作引导链(guiding strand)

Stealth RNAi™可以通过网络或电子邮件订购,可以提供20 nmol, 80 nmol, 1 µmol和1.7 µmol包装。它溶解在退火缓冲液中冻干后提供,同时提供1 mL DEPC水用于稀释。

Stealth Select RNAi™是预设计的靶向小鼠、大鼠和人的Stealth RNAi™分子。这些序列经过Smith-Waterman算法进一步减少了脱靶效应。这些序列主要是靶向ORF的,但是没有经过实验测试。这些RNAi可以在线订购,并可以在RNAi Express搜索引擎上查到。每个基因提供最好的3个不重叠序列,因此可以购买一套3个siRNA。序列在随产品附送的纸质版COA中提供。20 nmol的退火好的双链以冻干粉形式提供,同时带有1 mL DEPC水用于稀释。这些siRNA也可以1 nmol预制板形式订购。我们保证靶向同一基因的3个Stealth Select RNAi™ siRNA中有2个可以达到大于70%的基因敲低效果。

Validated Stealth RNAi™是预设计的并经过实验检测的Stealth RNAi™。这些siRNA是靶向人类基因的非重叠序列。它们以20 nmol退火好的双链冻干粉形式提供,同时带有1 mL DEPC水用于稀释。它们也可以1 nmol预制板形式订购。这些siRNA每条都有质保条款。

如果没有预设计的siRNA,您可以使用我们的计算工具根据目的mRNA核酸序列或数据库编号(accession number)(靶向非人类、小鼠和大鼠的物种;5’或3’ UTR)进行设计。RNAi Designer是一款免费在线工具,可以用于设计有效的Stealth RNAi™ siRNA。 RNAi Designer使用一种受专利保护的算法,这种算法是基于已发表的规则、复杂的同源序列去除、以及根据Invitrogen积累的大量成功RNAi实验室数据进行序列筛选。使用RNAi Designer,您可以针对感兴趣的目标mRNA设计出独特的、有效的Stealth RNAi™分子。如果您已有一个有效的siRNA双链序列,那么只需将其转换为一个有效的Stealth™并将获得所有Stealth RNAi™的优势。

RNAi Designer使用严格的规则筛选Stealth™ siRNA以确保它仅靶向您所选择的物种。Stealth RNAi™对于减小此类风险是最有效的,因为只有反义链可以产生RNAi效应.

所有Stealth siRNA™双链以退火好的冻干粉形式提供。

Stealth siRNA™以20 nmol退火双链形式提供。以24孔板用量(5 pmol/孔)为例,它可以用于大约4000次的转染。Invitrogen™可以根据要求对所选序列提供更大规模的合成。

Stealth Select套装中3条序列是单独包装提供的。冻干的RNA一旦被溶解配成所需浓度后可以立即用于转染。我们推荐单独转染以测试每个序列,因为将多个siRNA混合会增加细胞内产生脱靶效应的风险,而且需要进一步的分析以确定是哪条序列实现了有效的基因敲低。

我们为Stealth siRNA提供多个阳性和阴性对照:

Stealth阳性对照有:

-  Stealth RNAi™ siRNA Actin阳性对照(人)(货号12935141, 250 µL)

-  Stealth RNAi™ siRNA Cyclophilin B阳性对照(人)(货号12935142, 250 µL)

-  Stealth RNAi™ siRNA GAPDH阳性对照(人)(货号12935140, 250 µL)

-  Stealth RNAi™ siRNA β-Lactamase报告基因对照(货号12935148, 250 µL)

-  Stealth RNAi™ siRNA GFP报告基因对照(货号12935145, 250 µL)

-  Stealth RNAi™ siRNA Luciferase报告基因对照(货号12935146, 250 µL)

Stealth阴性对照有:

提供高(55-65% GC), 中(45-55% GC), 或低(35-45% GC)三种GC含量的双链siRNA对照:

-  高GC含量的Stealth RNAi™ siRNA阴性对照(货号12935400, 250 µL)

-  高GC含量的Stealth RNAi™ siRNA阴性对照#2(货号12935114, 250 µL)

-  高GC含量的Stealth RNAi™ siRNA阴性对照#3(货号12935115, 250 µL)

-  中GC含量的Stealth RNAi™ siRNA阴性对照(货号12935300, 250 µL)

-  中GC含量的Stealth RNAi™ siRNA阴性对照#2(货号12935112, 250 µL)

-  中GC含量的Stealth RNAi™ siRNA阴性对照#3(货号12935113, 250 µL)

-  低GC含量的Stealth RNAi™ siRNA阴性对照(货号12935200, 250 µL)

-  低GC含量的Stealth RNAi™ siRNA阴性对照#2(货号12935110, 250 µL)

-  低GC含量的Stealth RNAi™ siRNA阴性对照#3(货号12935111, 250 µL)

-  Stealth RNAi™ siRNA阴性对照试剂盒(货号12935100,包含每种GC含量阴性对照各20 µM各250 µL)

-  对于随机序列阴性对照,您可以使用BLOCK-iT RNAi Designer对您的siRNA或Stealth RNAi™序列进行打乱。

您也可以使用我们的BLOCK-iT AlexaFluorRed Fluorescent Control(货号14750100)或BLOCK-iTFluorescent Oligo(货号2013, 13750062)作为转染的对照。

最简单的方法是使用ID号(HSS, RSS, MSS)在线访问“Stealth快速订购”链接。也可提供购买后获得的序列作为“定制”Stealth分子而重新在线订购。

平均分子量是16,100 g/mol。

如果需要体内级别的和/或5’正义链标记(Biotin, Alexa Fluor 488, 546, 555, 647, 680, 750),您可以在我们的RNAi in vivo Designerpage订购。这些siRNA可以以HLPC纯化级别或体内脱盐级别或体内HPLC级别进行订购。

您可以订购Block-it RNA寡核苷酸或定制RNA寡核苷酸。Block-it RNA寡核苷酸是21-23碱基、非修饰的序列特异性RNA双链。要设计和订购BLOCK-iT™ siRNA,请访问BLOCK-iT™ RNAi Designer。定制siRNA也可以通过电子邮件订购

定制RNA寡核苷酸可以以单链或双链RNA订购。这些寡核苷酸最长50 bp,可以选择5’生物素、荧光素或磷酸基团修饰。它们仅能以脱盐纯化方式订购。要订购定制RNA寡核苷酸,请访问该网页

请提供基因数据库编号或核酸序列。您还可以选择您需要靶向的目的基因的特定区域:ORF, 5’ UTR或3’ UTR以及物种。siRNA的GC含量也可以选择。最后,您可以将您的输入序列在数据库中搜索比对以确保siRNA靶向特异性序列。

体内siRNA

请参考下列用于体内研究的不同类型的siRNA:

Ambion®In Vivo预设计siRNA使用Silencer® Select算法设计并带有额外化学修饰以获得超强血清稳定性(在37°C下90%小鼠血清中的半衰期>5小时)从而适用于体内实验。 Ambion®In Vivo siRNA在体外(外周血单核细胞;PBMC)和体内(小鼠)均无毒和无免疫源性。在细胞实验中,Ambion®In Vivo siRNA表现出和Silencer® Select siRNA相当的效果和特异性。

定制设计的Ambion® In VivosiRNA针对您的特定目的基因而设计,使用Silencer® Select算法并带有Ambion® In Vivo化学修饰。

定制合成的Ambion® In VivosiRNA根据您提供的序列合成,带有Ambion® In Vivo化学修饰以提高血清稳定性。

我们的Ambion®In Vivo siRNA可以以下列几种纯化级别订购:

脱盐:脱盐并使用MALDI-TOF质谱分析

HPLC:HPLC纯化并使用MALDI-TOF和分析级HPLC分析

In Vivo Ready:HPLC纯化,使用MALDI-TOF和分析级HPLC分析,透析脱盐,过滤灭菌,并经内毒素检测。

使用我们的GeneAssist工具订购您的定制siRNA。

  • 比非修饰siRNA稳定性>100倍——体内基因敲低效果更持久
  • 兼容于任何21-mer的序列——敲低能力不会损失
  • 无毒——实际上降低了siRNA序列特异的免疫反应
  • 高特异性——脱靶效应最高能降低90%
  • 提供预设计和经验证两种Ambion® In Vivo siRNA

化学修饰的siRNA双链相比标准siRNA双链有很多优势,包括低脱靶效应,高稳定性,以及低毒性。因为这些原因,我们推荐使用化学修饰的siRNA用于体内实验。对于一些目的只是确定生物分布的探索实验,非修饰的siRNA和荧光对照会更有帮助并且稍微便宜一些。

我们已经证明标记的Stealth和Silencer® siRNA不会影响它们的基因敲低能力。一个替代的方法是可以将非标记siRNA的和标记的对照siRNA混合;该方法更多用于体内siRNA实验,并可以使临床研究得以推进而不受标记可能带来的效应的影响。

对于 Stealth siRNA我们推荐选用HPLC in vivo纯化级别。对于Ambion® In Vivo siRNA,我们推荐in vivo ready纯化级别。

RNAi可以使用两种不同方法导入——合成的siRNA双链或通过质粒或病毒载体表达的siRNA(shRNA,miRNAi)。siRNA正成为快速发展的治疗应用的首选方法。它们易于使用,易于设计,并且易于合成。siRNA可以被快速鉴定并且可以同时靶向多个基因。对于RNAi载体而言,其表达可能由于质粒在基因组的稳定整合而更稳定持久,而它们也可以靶向非分裂细胞例如干细胞、淋巴细胞和神经元。RNAi载体的不足是插入突变导致的致癌风险,以及长期基因沉默和/或细胞内大量siRNA的存在导致的不可预测的毒性(Grimm D. et al.: Nature 441: 537-541 (2006))。

有数种不同的方法可以用于siRNA导入,包括多种局部导入技术和系统导入技术。我们提供一种脂质体试剂Invivofectamine® 3.0用于体内siRNA系统导入。点击此处了解更多关于此试剂的信息。

请联系rnairesearcher@invitrogen.com咨询大规模体内siRNA订购或填写询价表格

推荐进行内毒素检测以减少引发免疫反应的风险。

用于体内实验的Stealth siRNA双链可以使用BLOCK-iT™ RNAi Express订购,而Ambion® in vivo siRNA可以使用此工具订购。

Stealth siRNA比非修饰siRNA在血清中稳定的多。这一高稳定性对于体内实验尤其有好处,因为在体内RNAi分子会暴露于更多蛋白酶。通过与 Intradigm合作,Stealth RNAi™进行瘤内注射时已被证明具有体内活性。

我们提供下列体内siRNA对照:

  • Ambion® In Vivo阴性对照 #1 siRNA(货号4457287, 5nmol; 4459405, 50 nmol; 4457289, 250 nmol)
  • Ambion® In Vivo GAPDH阳性对照siRNA(货号4457288, 5 nmol; 4459407, 50 nmol, 4457291, 250 nmol)
  • Ambion® In Vivo Factor VII阳性对照siRNA(货号4459408, 50 nmol; 4457292, 250 nmol)
  • Silencer® Select阴性对照1号 siRNA, in vivo ready(货号4404020, 250 nmol)
  • Silencer® GAPDH阳性对照siRNA, in vivo ready(货号4404025, 250 nmol)

miRNA

miRNA (microRNA)是植物和动物基因组中天然产生的短链、高度保守的小非编码RNA分子。miRNA是单链的,长18-25nt并且可以调控转录后mRNA水平,它们通常结合互补mRNA序列的3’非翻译区(3’-UTR),导致翻译抑制和基因沉默。研究表明数以千计的人类蛋白编码基因被miRNA所调控,说明miRNA是很多重要生物进程的“重要调控者”。

siRNA通过序列特异的方式介导目标mRNA分子的降解,而miRNA抑制翻译而不剪切mRNA。

Ambion® Anti-miR™抑制物和Ambion® Pre-miR miRNA模拟物是我们的第一代抑制物和模拟物。Ambion® Anti-miR™抑制物是化学修饰的单链核酸,设计用于特异性结合并抑制内源microRNA (miRNA)分子。它们是可以使用转染或电转导入到细胞内的抑制物。针对miRBase version 15.0中的miRNA我们均设计了抑制物。

Ambion® Pre-miR miRNA模拟物是化学修饰的短双链RNA分子,设计用于模拟内源成熟的miRNA。这些miRNA模拟物类似于siRNA,但不等同于siRNA,它们可以使用类似于siRNA的参数被转染或电转导入到细胞内。请注意,Pre-miR miRNA模拟物虽然叫Ambion® Pre-miR miRNA Precursors,但并不是发夹结构,不能和miRNA前体相混淆。

mirVana™ miRNA模拟物和抑制物是我们的第二代模拟物和抑制物。mirVana™ miRNA模拟物是化学修饰的小双链RNA,它模拟内源成熟miRNA并通过上调miRNA活性使得研究miRNA功能成为可能。相比第一代模拟物它们的特异性有所提高,并且经HPLC纯化,可直接用于转染。

miRNA抑制物是化学修饰的小单链RNA分子,设计用于特异性结合并抑制内源miRNA分子并通过调低miRNA活性使得研究miRNA功能成为可能。相比第一代抑制物它们的性能有所提高。我们针对miRBase version 19.0中的miRNA均设计了抑制物。它们使用HPLC纯化,并可直接用于转染。想了解更多关于mirVana miRNA模拟物和抑制物的信息,请点击此视频。模拟物和抑制物均可以单独或作为文库订购。

它们既可用于体外也可用于体内实验,并且已验证可与Lipofectamine® RNAiMAX转染试剂连用用于细胞水平的实验,和Invivofectamine® 3.0试剂连用用于体内实验。这些寡核苷酸无毒并且在所测试的动物模型中未引发免疫反应。In vivo–ready mirVana™ miRNA模拟物和抑制物使用HPLC纯化并经过透析,可以直接用于体内实验。

点击下列链接以订购AAmbion® Pre-miR miRNA模拟物, Ambion® Anti-miR miRNA抑制物, 或mirVana™模拟物抑制物

点击此处查看4种产品的比较表格。对于所有文库咨询,请电邮:rnailibraries@lifetech.com

是的,请提交您的未发表的miRNA序列并/或点击此处订购定制修饰的miRNA。

我们可以对Pre-miR和Anti-miR miRNA进行标记,但不提供标记的mirVana™模拟物和抑制物。5’修饰包括Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 647, FAM®, 和Cy®3。请点击此处询价。

请访问miRBase: The microRNA database(microRNA数据库)。

mirVana™ miRNA模拟物的平均分子量是14,000 g/mol (1 nmol = 14 µg),mirVana™ miRNA抑制物的平均分子量是11,000 – 12,000 g/mol (1 nmol = 11 – 12 µg)。精确的分子量是保密的。

是的,我们提供mirVana™ miRNA模拟物的阳性和阴性对照。mirVana™ miRNA Mimic miR-1阳性对照(货号4464062, 4464063, 4464064, 4464065)被设计用于在哺乳动物细胞内模拟成熟miR-1 miRNA。miR-1和很多基因的敲低相关。特别是miR-1介导的Protein Tyrosine Kinase 9 (PTK9)敲低已被证明发生在mRNA水平。miR-1阳性对照可以作为mirVana™ miRNA模拟物进行转染时的阳性对照。使用实时RT-PCR检测PTK9 mRNA的表达来监控miR-1阳性对照的活性。

miR-1 miRNA 靶标PTK9的相关信息

基因标志

PTK9

基因全名

Protein tyrosine kinase 9

物种

人,小鼠

RefSeq编号

5756 (人), 19230 (小鼠)

Entrez基因ID

5756 (人), 19230 (小鼠)

推荐的针对PTK9的 Taqman基因表达检测用引物探针对*(不包含)

Mm01589891

Mm01589891

*用于实时RT-PCR检测PTK9 mRNA

mirVana™ miRNA模拟物的阴性对照 #1 (4464058, 4464059, 4464060, 4464061)设计作为使用mirVana™ miRNA模拟物时的阴性实验对照。转染阴性对照的方法与阳性对照 (如miR-1 Positive Control)和实验组mirVana™ miRNA模拟物的方法相同。使用转染阴性对照的样本中目的基因的表达作为本底来评估对照和实验组miRNA模拟物对目的基因的表达调控。mirVana™ miRNA模拟物阴性对照 #1是一个随机序列的miRNA模拟物,它已经在人类细胞系和组织中被广泛验证不会对已知miRNA产生可检测的效应。

是的,我们对于mirVana™ miRNA抑制物提供阳性和阴性对照。mirVana™ miRNA抑制物let-7c阳性对照被用来在哺乳动物细胞内进行mirVana™ miRNA抑制物(货号4464080, 4464081)实验时的阳性对照。内源let-7c miRNA被证明可以负向调控 HMGA2 mRNA在培养细胞中的表达。HMGA2是一个广泛表达的非组蛋白的染色质蛋白,可通过改变染色质构象而调控基因表达。let-7c miRNA可以敲低HMGA2 mRNA水平。当转染进人和小鼠细胞系内时,let-7c miRNA抑制物会抑制内源let-7c miRNA,导致HMGA2 mRNA水平提高。因此,可以通过实时RT-PCR检测HMGA2 mRNA而对let-7c miRNA抑制物在人和小鼠细胞内的活性进行监控。

mirVana™ miRNA抑制物阴性对照#1在进行mirVana™ miRNA抑制物(货号4464076, 4464077, 4464078, 4464079)实验时用作阴性对照。将此阴性对照和阳性对照(如let-7c阳性对照)和实验组mirVana™ miRNA抑制物作为平行实验同时转染。使用阴性对照转染样本中目的基因的表达作为基线评估对照和实验组miRNA抑制物对目的基因的表达调控。

将干粉状的寡聚核苷酸保存在–20°C或更低温度下的非自动除霜的冰箱中。将重悬后的寡聚核苷酸保存在–20°C或更低温度下,可保存较长时间(可长至一年),并且它们可经受多至50次的反复冻融而不会产生显著降解。我们建议将重悬后的miRNA分装以避免污染。可以存储在–80°C但并不必要。工作溶液可以在使用前保存在4°C多至7天。

请电邮 techsupport@lifetech.com 提出您的请求。阴性对照需要提供购买证明才能给出序列。

是的,请将您未发表的miRNA序列提供给我们,我们可以合成一个相应的mirVana™模拟物或抑制物,请点击此链接订购。

交货时间取决于纯化程度和是否是定制订单。请参考以下大致时间表(中国需要加上国际运输时间):

标准纯化(5 and 20 nmol)

4个工作日

HPLC/in vivo ready (250 nmol)

15个工作日

定制mirVana™抑制物和模拟物

15个工作日

模拟物和抑制物可以使用和siRNA相同的参数通过转染或电转进入细胞。

使用mirVana™ miRNA模拟物

为了后续应用,请使用一种对于您感兴趣的miRNA表达相对较低的细胞系。

• 转染时的细胞密度通常建议30–70%汇合度。

• 转染方法(传统转染或反式转染)。

• 细胞暴露于转染试剂-RNA寡核苷酸复合体的时长。

对于大部分miRNA模拟物而言,最大活性在转染后24小时候产生,但是生物检测实验可以在转染后24–72小时内进行。如果转染后的细胞培养超过24小时,我们建议更换新鲜的培液以便获得更好的细胞活力。

使用 mirVana™ miRNA抑制物分析内源miRNA功能

为了后续应用,请使用一种对于您感兴趣的miRNA表达相对较高的细胞系。

通用转染起始点

mirVana™ miRNA模拟物和抑制物通常在3–30 nM浓度转染时效果最好。优化实验可以包括1–100 nM的浓度范围。在准备转染复合体时,为提高精确性和可重复性,可以先稀释您的寡聚核苷酸储液,并加入较大体积的稀释后的溶液。

使用TaqMan® miRNA Assay,您可以测定感兴趣的miRNA的水平。如果miRNA与转染进细胞的anti-miR和/或mirVana™抑制物相结合,那么miRNA将不会被检测到,证明miRNA的有效失活。请注意,这仅适用于当提取的总RNA样本在加入RT引物时没有进行热变性的情况,因为热变性将导致复合体解体,这样即使细胞已被正确的转染,TaqMan® miRNA Assay将仍能检测到miRNA。更多细节请参考TaqMan® MicroRNA Cells-to-CT试剂盒(货号4391848)的实验方案。

下列是我们提供的用于体内miRNA研究的对照:

  • mirVana™ miRNA模拟物,mir-1阳性对照(25 nmol, 4464065)
  • mirVana™ miRNA模拟物阴性对照1号(250 nmol, 4464061)
  • mirVana™ 抑制物阴性对照1号 (250 nmol, 4464079)

请访问我们的 转染支持中心 查找有关转染的技术支持资源、使用建议和技巧,以及问题排查信息。

定制RNA寡核苷酸

RNA合成所用的化学方法和DNA合成所用的方法相同,除了在核糖的2'羟基位填加了额外的保护基团。该位置被甲硅烷基保护,在整个合成过程中保持稳定。糖基和碱基上其它位置的保护方式与DNA合成时相同。

RNA可以使用分析级HPLC纯化。也可以订购为默认的纯化级别即脱盐纯化的RNA。我们对退火后的双链不提供额外的纯化方法。

脱盐意味着合成时的盐被除去但合成失败的序列没有被除去。HPLC纯化意味着全长的多聚物被纯化出来而合成失败的短链被除去。

目前合成RNA寡聚核苷酸的最大长度是50个碱基。

98.5% 

我们提供的合成规模是50 nM和200 nM。合成规模是指起始材料的量,而不是最终产物的量。请查看我们的最低产量保证以确定我们基于合成规模和纯化方法的RNA产量保证。

RNA寡核苷酸以冻干粉形式提供。

对于单链RNA,产品文件中包括了每个RNA寡核苷酸质量,摩尔数,以及OD数。对于双链RNA,产量在试管上有标注。

请参考RNA寡核苷酸订购页面的5’和3’修饰选择。

是的,只要在订购的序列中加入TT即可。

最好的方法是将RNA以干粉形式保存在–20°C或–80°C。

作为干粉它们可以在–20°C保存6个月。

我们建议将单链RNA溶解在1X TE缓冲液中(在无RNase条件下制备的10 mM TrisCl, pH 7.5, 0.1 mM EDTA)。该缓冲液有合适的pH值并螯合了可能导致RNA降解的金属离子。无RNase水也可以用于溶解。双链RNA(siRNA)以10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA溶液的冻干粉提供。请将其溶解在适量的无核酸酶的水中使RNA浓度达到20 µM,这将还原其冻干前的缓冲液。

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