Dados de amostra de HCS e HCA

Triagem de imunoensaio de alto rendimento possibilitada pelo uso das novas plataformas CellInsight CX7 Pro

Comparação do imunoensaio sem lavagem FirePlex™-HT entre os aparelhos CellInsight CX7 e CX7 Pro. O ensaio FirePlex sem lavagem otimizado para triagem de alto rendimento foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante para detectar 5 e 10 analitos por poço. Uma curva padrão de 10 pontos foi quantificada para avaliar a reprodutibilidade do analito e os intervalos dinâmicos. O ensaio resultante foi medido usando as plataformas CellInsight CX7 (imagens à esquerda) ou CX7 Pro (imagens à direita) e quantificado usando o software FirePlex Analysis Workbench. Somente o instrumento CX7 Pro (imagens à direita) foi capaz de exceder o intervalo dinâmico de 2,5 (15 bits) ou 3,0 (16 bits) e menos de 15% de CVs intraplaca. O desempenho significativamente melhor do intervalo dinâmico e da reprodutibilidade se deve à óptica superior do instrumento CX7 Pro e à capacidade de detecção QE de 95%. Este experimento foi validado pela Abcam™ usando os modos de câmera CX7 Pro sCMOS de 15 e 16 bits para considerações de triagem HT.

Aplicação imuno-oncológica: Captura de imagens da morte celular dependente de anticorpos em esferoides de câncer de mama

Morte celular dependente de anticorpos em esferoides de câncer de mama. As células natural killer humanas isoladas com o kit Dynabeads Untouched Human NK Cells foram marcadas com o corante  CellTracker Deep Red. As células de câncer de mama humano (SKBR3) foram cultivadas durante a noite em placas Nunclon Sphera de 96 poços para formar esferoides, tratadas com o anticorpo anti-HER2 trastuzumabe e, em seguida, desafiadas com células NK por 4 horas. As células foram coradas com o  CellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagent e Hoechst 33342 e as imagens foram obtidas no CellInsight CX7 LZR High-Content Screening. Plataforma. As imagens são projeções de intensidade máxima de múltiplas seções z. O reagente CellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagent foi usado para estudar a apoptose mediada por células NK e anticorpos em esferoides. O CellTracker Deep Red foi usado para rastrear as células NK dentro do esferoide. O trastuzumabe ligado ao HER2 nas células SKBR3 amplifica a resposta antitumoral das células NK por meio da apoptose celular dependente de anticorpos.

Aplicação de análise e geração de imagens de esferoides: segmentação e quantificação da proliferação de EdU e tamanho esferoide

Segmentação e quantificação de EdU e tamanho do esferoide usando o sistema CellInsight CX7 LZR. As células A549 foram colocadas em uma densidade de 5.000 células por poço em uma microplaca Nunclon Sphera de 96U e incubadas por 24 horas em uma incubadora de CO2. EdU foi adicionado na concentração final de 10 μM e incubado por 1 h. Em seguida, os esferoides foram lavados e fixados com formaldeído a 4% e permeabilizados com Triton X-100 a 0,25%. Os esferoides foram então corados para EdU usando o Kit de ensaio Click-iT EdU Alexa Fluor 488 HCS  de acordo com o protocolo do kit. As imagens da placa foram obtidas com uma objetiva de 4x usando o modo confocal em uma plataforma de triagem de alto conteúdo CellInsight CX7 LZR. A imagem é uma projeção de intensidade máxima de 200 camadas ópticas em z de 1 mícron cada. A quantificação foi realizada com o software HCS Studio 2.0 usando o bioaplicativo Morphology Explorer. O esferoide foi segmentado como um objeto, e as células positivas para EdU foram contadas como pontos dentro do esferoide. Usando a aplicação biológica do Morphology Explorer, os esferoides foram segmentados como um objeto inteiro, e as células positivas para EdU foram segmentadas dentro do esferoide e o número de células foi plotado.

Imagens confocais de esferoides 3D em modo de células vivas para aplicações biológicas

Imagens confocais de esferoides 3D no modo de células vivas. (A) As células A549 foram plaqueadas a uma densidade de 5.000/poço em uma placa de fundo em U e incubadas por 48 horas na incubadora de CO2. Os esferoides vivos foram marcados para células vivas e mortas com um Kit de viabilidade/citotoxicidade LIVE/DEAD. A imagem da placa foi obtida automaticamente com a objetiva de 10x usando o confocal em um aparelho CellInsight CX7 LZR HCS. A imagem é uma projeção de intensidade máxima de múltiplas seções z. Células mortas coradas foram observadas no núcleo esferoide (vermelho) e células vivas (verde) foram observadas na periferia dos esferoides. (B) As células A549 foram plaqueadas a uma densidade de 5.000/poço em uma placa de fundo em U e incubadas por 24 horas na incubadora de CO2. Os esferoides vivos foram então corados com MitoTracker Orange CMTMRos e CellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagent por 30 min. A imagem da placa foi obtida automaticamente com a objetiva de 10x usando o confocal em um aparelho CellInsight CX7 LZR HCS. A imagem é uma projeção de intensidade máxima de múltiplas seções z. Nos esferoides vivos do A549, a maioria das células está saudável, conforme observado pela coloração com MitoTracker Orange, e foram observadas bem poucas células apoptóticas. (C) As células A549 foram plaqueadas a uma densidade de 5.000/poço em uma placa de fundo em U e incubadas por 24 horas em uma incubadora de CO2. Os esferoides vivos foram então corados com o reagente  Image-iT Green Hypoxia Reagent  por 30 minutos. A imagem da placa foi obtida automaticamente com a objetiva de 10x usando confocal em um aparelho CellInsight CX7 LZR HCS. A imagem é uma projeção de intensidade máxima de múltiplas seções z. Os esferoides A549 vivos apresentam coloração de hipóxia com o Image-iT Green Hypoxia Reagent. (D) As células SKBR3 foram plaqueadas a uma densidade de 5.000/poço em uma placa de fundo em U e incubadas por 24 horas em uma incubadora de CO2. Os esferóides vivos foram então incubados com o anticorpo Herceptina conjugado com pHrodo Red por 24 horas. A imagem da placa foi obtida automaticamente com uma objetiva de 4x usando o confocal em um aparelho CellInsight CX7 LZR HCS. A imagem é uma projeção de intensidade máxima de múltiplas seções z. O anticorpo Herceptina conjugado com pHrodo internalizado é observado nas vesículas intracelulares. (E) As neuroesferas foram diferenciadas das células-tronco neurais (CTN) em  meio  Neurobasal Plus com  o suplemento Culture One. As neuroesferas vivas foram então coradas com Tubulina Tracker Deep Red por 1 hora. A imagem da placa foi obtida automaticamente com a objetiva de 4X usando o confocal em um aparelho CellInsight CX7 LZR HCS. A imagem é uma projeção de intensidade máxima de múltiplas seções z. A tubulina Tracker Deep Red cora os neuritos nas neuroesferas diferenciadas de CTN. (F) As células HeLa foram plaqueadas a uma densidade de 5.000/poço em uma placa de fundo em U e incubadas por 24 horas em uma incubadora de CO2. As células T ativadas foram marcadas com CellTracker Deep Red e cerca de 5.000 células foram adicionadas a cada poço. Após 2 horas de incubação com células T ativadas, os esferoides foram corados com indicador de pH intracelular pHrodo Green AM por 30 min. Em seguida, as células foram lavadas três vezes com PBS e as imagens foram obtidas com uma objetiva de 4x usando o confocal em um aparelho CellInsight CX7 LZR HCS. A imagem é uma projeção de intensidade máxima de múltiplas seções z. Aumento intracelular da fluorescência do pHrodo Green AM após adição de células T ativadas.

Imagem e análise de células em proliferação em esferoides

Análise de células em proliferação em esferoides HeLa. As células HeLa foram plaqueadas em uma densidade de 5.000/poço em uma placa de fundo em U Nunclon Sphera e incubadas por 24 horas em um sistema de CO2 Os esferoides foram tratados com hidroxiureia 50 μM por 24 horas. Em seguida, os esferoides foram pulsados com 10 µM de 5-etinil-2'-deoxiuridina (EdU) por 30 minutos. Em seguida, os esferoides foram lavados com PBS e corados para detectar células em proliferação usando o  ensaio Click-iT EdU Alexa Fluor 488 HCS. Os esferoides foram então lavados e corados com um anticorpo Ki67 conjugado ao corante Alexa Fluor 647. A imagem da placa foi obtida automaticamente com uma objetiva de 10x usando o confocal em um aparelho CellInsight CX7 LZR HCS. A imagem é uma projeção de intensidade máxima de múltiplas seções z. Os esferoides foram segmentados como um objeto, e as células positivas para EdU e Ki67 foram quantificadas como pontos dentro do esferoide. Células positivas para EdU e Ki67 foram observadas em esferoides controle. Nos esferoides tratados com hidroxiureia, as células em fase s de proliferação ativa desapareceram (EdU negativo) e somente as células positivas para Ki67 foram observadas.

Aplicação imuno-oncológica: Imagem de penetração de células T e morte de esferoides de câncer de pulmão

Penetração de células T e morte de esferoides de câncer de pulmão. Os esferoides foram formados pela propagação de células A549 usando o meio essencial mínimo (MEM) da Gibco em placas de fundo em U Nunclon Sphera e cultivadas por 2 dias. Células T isoladas do CMSPs humano usando Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28 foram ativadas por 72 horas e marcadas com CellTracker Deep Red Dye antes de adicionar a esferoides de câncer de pulmão por 4 horas. As células foram marcadas com CellEvent Caspase 3/7 Reagent. A penetração das células T e a citotoxicidade do tumor foram avaliadas por meio de imagens de esferoides inteiros de células vivas na plataforma de alto conteúdo CellInsight CX7 LZR. As células T ativadas penetraram nos esferoides (vermelho) e induziram a apoptose nas células-alvo em todos os esferoides, conforme observado pelo aumento da coloração com o reagente CellEvent Caspase 3/7 (verde).