从异质性样本中获取特定的细胞群是特定细胞类型基因表达谱研究中面临的主要挑战。 激光捕获显微切割 (LCM) 是由NIH和Arcturus, Inc.合作开发的,专用于从正常组织中分离癌症细胞,可以采用该方法从复杂组织和器官中分析单个细胞类型。 随后从显微切片中提取RNA,用于基因表达分析。

LCM的工作原理

LCM可以从薄组织切片中选择并捕获细胞或者不同的形态结构。 通过固定、染色和脱水制备OCT包埋冰冻组织切片,用于LCM过程。 然后通过粘附在微量离心管盖底部的热塑薄膜显示切片。 激光脉冲穿过薄膜直接射在靶细胞上。 目标区域上的塑料薄膜被熔化,随后冷却并与下层的细胞结合。 然后收集薄膜连同其粘附的靶细胞。 从上述捕获的细胞中分离RNA,用于实时荧光定量RT-PCR和mRNA表达图谱分析。

获取高品质RNA的小技巧

Ambion优化了用于LCM的组织处理和染色过程,下面我们将提供一些建议,避免缺陷并从LCM样本中获取高品质RNA。

冷冻并包埋组织:

  • 冷冻样本以迅速保存RNA至关重要。 我们一般使用组织冷冻喷雾,如Cytocool II (Richard Allen Scientific) 瞬间冻结样本,但亦可使用液氮。
  • 尽管未包埋冷冻组织也可用于冰冻切片,但我们推荐使用冷冻包埋基质 (如TissueTek O.C.T.) 包埋样本,有助于在切片过程中保存形态学特征。
  • 在包埋组织时使样本保持冷却;使用一次性乙烯样品包埋模具在干冰上包埋冷冻组织。

冰冻切片组织:

  • 用RNaseZap® (Ambion) 清洁样品台,并涂上一层O.C.T.,将组织置于台上。 将样品台置于干冰内,在处理前使O.C.T.冷冻。 这层额外的包埋剂有助于防止在冰冻切片过程中,切刀将组织从台面上碰掉。
  • 确保在冰冻切片前,将包埋组织平衡至冷冻台的温度。 最佳切割温度为–10至–60°C,具体取决于组织的脂肪含量。
  • 在切片过程中使组织保持冷却,以免RNA降解。 如果在此过程中组织温度升高,则喷洒组织冷冻喷雾,快速冷却组织或仪器。
  • 将显微镜载玻片盒置于干冰上,立即将切片的载玻片置于预冷的盒内。 如果在切片后立即进行染色,则更方便的做法是在开始染色前,先将其保存在低温恒温器内。
  • 冷冻切片的玻片可以安全地冷冻,以供稍后使用。 在载玻片盒中加入一小包干燥剂 (吸附剂),以实验薄膜密封,置于–80ºC下储存待染色。

玻片固定并染色:

  • 为避免将残留的乙醇带到下一步骤,在吸附剂表面轻轻拍打玻片,去除多余的乙醇。
  • 使用分子筛 (如EMD化学分子筛,4A型,8–12目微珠) 用于100%乙醇,减少水分积聚。
  • 要获得出众的冷冻切片染色效果,同时保护RNA质量,供下游应用,请查看Ambion的LCM染色试剂盒。

确保冰冻切片样本充分脱水:

在开始LCM前,使样本充分脱水至关重要。 潮湿样本易受静水压力作用,LCM后难以从载玻片和周围组织中分离目标组织。 脱水不充分的样本一般半透明度更高,且表面更亮。

  • 经常更换乙醇和二甲苯固定液。
  • 如果您脱水时间较短时,脱水不充分,可以将乙醇/水溶液处理的时间延长至30秒,将100%乙醇处理的时间延长至1分钟。
  • 增加10秒的二甲苯处理步骤,然后在脱水后利用二甲苯去除乙醇5分钟。
  • 高湿度会对LCM实验产生严重影响。 如果在您设置过程中存在湿度问题,则使用湿度计监测室内湿度,并采用除湿器将环境湿度保持在25–45%范围内。

进行LCM并开始RNA提取步骤

  • 载玻片固定并染色后,应立即进行LCM,将RNA降解程度降至最低。
  • 使用胶条 (如Arcturus的Prep Strip™) 去除载玻片上的疏松组织,然后进行LCM。
  • 采用胶条 (如Arcturus的Capsure Cleanup Pads) 去除热塑薄膜上的外源性组织。
  • 要最大化微切割组织中的RNA回收量,采用尖镊子撕下Capsure® LCM Cap (Arcturus) 上的热塑薄膜,将其扔至裂解液中。

从微切割组织中提取RNA

推荐使用Ambion的RNAqueous®-Micro试剂盒,回收LCM微切割组织中的RNA。 该试剂盒是基于硅胶基质上的RNA固相提取。 过滤器的结构可实现RNA的少量回收 (~20 µl)。 试剂盒还包含去除污染的基因组DNA所需的试剂。