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概述

酵母是一种单细胞的真核生物,在成分确定培养基中可快速生长(在含葡萄糖培养基中的倍增时间通常为2.5小时),相比使用昆虫或哺乳细胞生产重组蛋白更简单、更便宜(见下表)。这些良好的特性使酵母适用于从多孔培养板、摇瓶和持续搅拌槽生物反应器到小型试验工厂和工业规模反应器等多种形式的蛋白制备。

实验室最常用的酵母种类是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,又名Baker或Brewer酵母)和一些毕赤酵母属(Pichia)的甲醇营养型酵母。S. cerevisiaeP. pastoris的遗传性质均已明确,并能够对蛋白进行翻译后修饰,包括二硫键形成和糖基化,这对于一些重组蛋白发挥正常功能具有重要作用。但是,应注意酵母的糖基化与哺乳细胞的有所不同:在S. cerevisiae中,O-连接的寡糖只有甘露糖残基,而更高等的真核蛋白有唾液酸化的O-连接糖链。此外,已知S. cerevisiae可过度糖基化N-端位点,从而导致蛋白质结合和活性发生改变,并可能在治疗应用中产生异常的免疫原应答。在P. pastoris中,寡糖链的长度短很多,并且已有一个P. pastoris株被报导可产生复杂的、末端唾液酸化的或“人源化”的糖蛋白。

特点 大肠杆E. coli 酵母 昆虫细胞 哺乳细胞
细胞生长 快(30分钟) 快(90分钟) 慢(18-24小时) 慢(24小时)
生长培养基复杂度 极低 极低 复杂 复杂
生长培养基成本
易用性 容易 容易至中度复杂 复杂 复杂
表达水平 低-高 低-高 低-中
细胞外表达 分泌到周质 分泌到培养基 分泌到培养基 分泌到培养基
翻译后修饰 大肠杆菌 酵母 昆虫细胞 哺乳细胞
蛋白折叠 通常需要重折叠 可能需要重折叠 正常折叠 正常折叠
N-端糖基化 高甘露糖 简单,无唾液酸 复杂
O-端糖基化
磷酸化
乙酰化
酰化
γ-羧化

我们提供original Pichia pastoris表达系统、PichiaPink™表达系统和Saccharomyces cerevisiae酿酒酵母表达系统,用于重组蛋白表达。已知P. pastorisS. cerevisiae遗传性质已十分明确,均可进行多种翻译后修饰。

P. pastoris毕赤酵母表达系统结合了大肠杆菌表达(高水平表达、易于扩大规模和低成本)和真核系统表达(蛋白加工、折叠和翻译后修饰)的优势,从而可对有功能活性的重组蛋白进行高水平生产。作为一种酵母,毕赤酵母Pichia pastoris与酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae具有相似的分子和基因操作优势,而且其外源蛋白表达水平比酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae高10-100倍。这些特性使毕赤酵母Pichia pastoris 非常适合用作蛋白表达系统。Pichia表达载体含有强乙醇氧化酶(AOX1)启动子,用于高水平、严格调控的诱导型的表达;或者含有甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子,用于高水平的组成型表达。诱导型和组成型表达构建体均整合到P. pastoris基因组,建立蛋白表达水平极高的稳定宿主,特别是在使用发酵器的情况下。我们可提供的Pichia pastoris表达系统包括:

  • PichiaPink™酵母表达系统:最新的Pichia pastoris表达系统包含低拷贝和高拷贝质粒骨架、8种分泌信号序列和4种酵母菌株,这些有助于优化得到最高的重组蛋白产率。所有PichiaPink™载体都含有AOX1启动子,用于高水平诱导型表达;还含有ADE2标记物,利用ADE2互补作用筛选转化株(即腺嘌呤缺陷型的互补)而不是抗生素筛选。但是,它们通过不同长度的启动子表达ADE2基因产物,从而决定了整合质粒的拷贝数。在pPink-LC载体中,ADE2标记物的启动子为82 bp,可提供低拷贝表达;在pPink-HC载体,ADE2标记物的启动子为13 bp,可提供高拷贝表达。该系统也可诱导pPinkα-HC载体(含S. cerevisiae α-交配因子前导序列)产生高拷贝数分泌表达,并且还包含8种分泌信号序列可优化分泌表达。
  • EasySelect™ Pichia表达试剂盒:一种传统Pichia 表达试剂盒,包含pPICZ和pPICZα载体,可分别用于目的基因的细胞内和分泌表达。这些载体含有AOX1启动子,可产生高水平的诱导型表达;还含有Zeocin™抗生素抗性标记物,可直接进行多拷贝整合载体的筛选。它们有助于对表达的蛋白进行简单的亚克隆、纯化以及快速检测。
  • Original Pichia表达试剂盒:该试剂盒包含pPIC9、pPIC3.5、pHIL-D2和pHIL-S1载体,每种载体都含有AOX1启动子,可产生高水平的诱导型表达;还含有HIS4基因,用于在缺乏组氨酸的培养基上筛选his4酵母株。pPIC9带有S. cerevisiae α-因子分泌信号,而pHIL-S1带有Pichia pastoris碱性磷酸酶信号序列(PHO),可指导蛋白质向培养基的转运。pHIL-D2和pPIC3.5专为细胞内表达而设计。
  • 多拷贝Pichia表达试剂盒:该试剂盒专为最大化表达而设计,包含pPIC3.5K、pPIC9K和pAO815载体,可产生和选择含多个目的基因的Pichia菌株。它们可通过体内方法(pPIC3.5K和pPIC9K)或体外方法(pAO815)分离和生成多拷贝插入片段。所有这些载体都含有AOX1启动子,可产生高水平的诱导型表达;还含有HIS4基因,用于在缺乏组氨酸的培养基上筛选his4菌株。pPIC9K载体可指导表达蛋白的分泌,而从pPIC3.5K和pAO815载体表达的蛋白仍留在细胞内。pPIC9K和pPIC3.5K载体带有卡那霉素抗性标记物,从而使Pichia对Geneticin试剂产生抗性。可通过Geneticin试剂抗性水平高低来鉴定自发的多次插入事件。在缺乏组氨酸的培养基上对Pichia转化株进行筛选,并筛选它们对Geneticin试剂的抗性水平。在高浓度Geneticin试剂中的生长能力,表示多拷贝的卡那霉素抗性基因以及目的基因被整合到了基因组。

为实现在S. cerevisiae中的表达,我们提供pYES™ 载体系列。每个pYES™载体都带有GAL1基因的启动子和增强子序列,可实现诱导型表达。GAL1启动子是使用最广泛的酵母启动子之一,因为它在半乳糖的诱导下具有很强的转录活性。pYES™载体还具有2 µ复制起点,可以维持游离的高拷贝数(10-40拷贝/细胞)。

P. pastoris表达系统结合了大肠杆菌表达(高水平表达、易于扩大规模和低成本)和真核系统表达(蛋白加工、折叠和翻译后修饰)的优势,从而可使有功能活性的重组蛋白进行高水平生产。Pichia pastorisSaccharomyces cerevisiae具有相似的分子和基因操作优势,而且其外源蛋白表达水平比Saccharomyces cerevisiae高10-100倍。在S. cerevisiae中,质粒复制进行游离表达;而在Pichia pastoris中,质粒整合到宿主染色体中。

Saccharomyces cerevisiae相比,Pichia在分泌蛋白的糖基化方面具有优势,因为它可能不会过度糖基化。Saccharomyces cerevisiaePichia pastorisN-连接糖基化主要是高甘露糖形式;但是,在Pichia中,翻译后添加到蛋白上的寡糖链长度(平均每条侧链为8-14个甘露糖残基)比Saccharomyces cerevisiae(50-150个甘露糖残基)短很多。在Pichia中观察到的O-连接糖基化非常少。此外,Saccharomyces cerevisiae核心寡糖具有末端α1,3聚糖连接头,而Pichia pastoris没有。人们认为Saccharomyces cerevisiae生产的糖基化蛋白的α1,3聚糖连接头,主要将导致这些蛋白具有高抗原性,使得它们特别不适合于治疗用途。尽管尚未被证明,但推测这一点在Pichia pastoris生产的糖蛋白中不是一个大问题,因为这些糖蛋白可能与更高级的真核糖蛋白结构相似。

我们建议将酵母置于15%甘油中保存在–80°C。甘油储液可长期保存(除非经过多次冻融)。在制备甘油储液时,我们建议使用过夜培养物并将其浓缩2-4倍。将细胞离心,并使用原始体积25–50%的甘油/培养基重悬。最好使用新鲜培养基加甘油冻存细胞,而不仅仅是将甘油加到过夜培养物中这么简单。

Pichia表达系统

PichiaPink™酵母表达系统比传统EasySelect™ Pichia系统具有显著的优势,具体如下:

  PichiaPink™酵母表达系统 EasySelect™酵母表达系统
质粒拷贝数 同时具有高拷贝和低拷贝,可优化毒性蛋白表达 仅具有高拷贝数
分泌信号前导序列数量 8 1
酵母株数量 4 3
蛋白酶缺陷型宿主株数量 3 0
抗生素抗性标记物 无,依赖于腺嘌呤筛选 有,使用Zeocin™抗生素

The PichiaPink™系统利用ADE2互补作用筛选转化株(即腺嘌呤缺陷型的互补)而不是抗生素筛选。ADE2基因可编码磷酸核糖酰氨基眯唑羧化酶,该酶可催化嘌呤核苷酸从头生物合成的第六步。ADE2突变可导致嘌呤前体在液泡中的累积,从而使菌落变成红色。此外,ade2突变体是腺嘌呤营养缺陷型的,在缺乏腺嘌呤的培养基中不能生长,在营养丰富型培养基中生长较慢。

PichiaPink™系统中,由于ADE2基因及其部分启动子完全缺失,菌株为ade2缺陷型。PichiaPink™表达载体系统以ADE2基因(由其自身的启动子驱动)为筛选标记物,其高拷贝载体(pPink-HC和pPinkα-HC)含截断的ADE2启动子,而低拷贝载体(pPink-LC)含全长ADE2启动子。使用表达质粒对PichiaPink™酵母株进行转化,可使酵母株在缺乏腺嘌呤的培养基上生长(腺嘌呤缺陷型或基本培养基)。无论使用哪种宿主PichiaPink™酵母株,使用高拷贝PichiaPink™载体进行转化,都能在筛选培养皿上得到白色和淡粉色菌落。菌落颜色间接表明了目的蛋白的相对表达水平,因为菌落颜色取决于质粒拷贝数,而质粒拷贝数取决于标记物的启动子长度。粉色菌落可表达非常少的ADE2基因产物,而白色菌落可表达较多的ADE2基因产物,表明这些菌落具有更高的整合构建体拷贝数。使用低拷贝质粒pPink-LC转化的酵母株,在缺乏腺嘌呤的培养基上生长速度更快,该载体上具有较强的启动子,因而可生成白色克隆。由于具有较强的启动子,较少的ADE2表达就能使酵母株在缺乏腺嘌呤的培养基上生长。因此,酵母株中的ADE2基因/表达构建体拷贝数较低。

EasySelect™ Pichia表达试剂盒的特色为使用Zeocin™抗生素筛选进行多拷贝筛选,可实现Multi-Copy Pichia表达试剂盒能做到的所有事。Multi-Copy试剂盒的pAO815载体适用于体外多聚化。其他Multi-Copy载体具有低表达水平的卡那霉素抗性基因(使酵母对Geneticin产生抗性)。

EasySelect™ Pichia表达试剂盒利用Zeocin™抗生素代替HIS标记物,简化并提高了筛选效率。该试剂盒还带有EasyComp™ Pichia转化试剂盒,代替了Pichia原生质球试剂盒。

在酵母中,Kex2从过表达蛋白的N端切割α分泌信号肽。尽管Ste13通常可除去Kex2位点和您的目的蛋白之间的Glu-Ala氨基酸,但Ste13切割可能并不完全。为了确保在Kex2切割后能使目标蛋白的N端暴露,您可克隆目的基因至与Kex2切割位点齐平的位置。为了将目的基因克隆至与Kex2切割位点齐平的位置,您必须使用XhoI(和任何其他合适的酶与载体3’末端进行克隆)切割pPICα载体。单独使用XhoI对载体进行切割,您将切除载体上62-67个核苷酸(取决于所用载体),包括Kex2信号切割位点。为了再生成Kex2信号切割位点,您将需要合成一个包含Xhol位点的正向引物,其后连接着Kex2切割序列和目的基因的核苷酸。

扩增目的基因后,您将使用Xhol对PCR产物进行消化,如果需要,可使用另一个限制酶切消化,保持您的目的基因与C端标签读码框一致。

请注意:Glu-Ala-Glu-Ala序列对于切割并不是完全必要的,但确实具有一定影响。通常,多种kexin基因的切割效率可受到Lys-Arg二元基序的上游和下游序列影响,但不同成员的效率有所不同。N端序列可能不重要,但是,可产生二级结构并掩盖切割位点的氨基酸序列可能会产生问题。KEX2切割位点后可以存在多种氨基酸:包括芳香族氨基酸、小氨基酸、组氨酸和甲硫氨酸。脯氨酸会抑制KEX2的活性。

Pichia methanolica 表达系统已停产。

是的,我们的甲醇、甲胺或甲醇加甲胺型Pichia系统可提供pFLD和pFLDα载体,用于高水平的诱导型表达。

Pichia基因组与其他酵母的相似,约为1.5 x 107 bp(与S. cerevisiae相似),并包含4个染色体(与S. pombe相似)。参考文献:Ohi H, Okazaki N, Uno S, Miura M, Hiramatsu R (1998) Chromosomal DNA patterns and gene stability of Pichia pastoris. Yeast 14(10):895–903.

我们利用等强度均电场凝胶电泳,从Pichia pastoris(Komagataella pastoris)酵母株中分离出清晰的4个染色体条带。P. pastoris染色体条带的大小为1.7 -3.5 Mb,总基因组大小预计为9.5-9.8Mb;但是,4个酵母株中的染色体长度呈多态性。

在含葡萄糖的SC培养基中,Pichia的倍增时间约为2–3.5小时。酵母在30°C生长缓慢,至少需要3天时间才能长出菌落。实际上,需要3-7天的时间才能够得到大小合适的菌落。

OD600值为1相当于5 x 107Pichia细胞/毫升。挑选出的菌落生长过夜(O/N)后,Pichia培养物通常可达到OD1.3–1.5(在2–5 毫升中)。

pPIC9K中卡那抗性基因是克隆在其天然启动子下游的。它没有克隆在Pichia或其他酵母启动子下游,导致其表达水平极低。因此,若想获得G418的抗性,需要多拷贝的整合体。

密码子选择是否和通常认为的那样具有重要作用是值得怀疑的。翻译起始比延伸更可能成为限速步骤。

使用以下密码子选择清单,按偏好顺序来设计您的基因:

甘氨酸:GGT或GGA
谷氨酸:GAG或GAA
天冬氨酸:GAC或GAT
缬氨酸:GTT或GTC
丙氨酸:GCT或GCC
精氨酸:AGA或CGT
丝氨酸:TCT或TCC
赖氨酸:AAG
天冬氨酸:AAC
甲硫氨酸:ATG
异亮氨酸:ATT或ATC
苏氨酸:ACT或ACC
色氨酸:TGG
半胱氨酸:TGT
酪氨酸:TAC
亮氨酸:TTG或CTG
苯丙氨酸:TTC
谷氨酰胺:CAA或CAG
组氨酸:CAC或CAT
脯氨酸:CCA或CCT

pTEF1/Zeo是一种ZeoCassette™载体,包含受S. cerevisiae TEF1启动子和细菌EM7启动子控制的Zeocin™抗生素抗性基因。ZeoCassette™两侧包含多聚接头,可用于切割ZeoCassette™使其适用于不同载体。此外,将不同的元件克隆到ZeoCassette™载体骨架中,可生成新的载体。Saccharomyces TEF1启动子在Pichia pastoris中是有活性的。

尽管不同信号的效率可能不同,但是,哺乳类分泌信号通常在酵母中是可以发挥功能的。

α“信号序列”(实际上含有α信号序列和激素原前导序列)被Pichia 细胞中3种不同的酶切割4次。首先,信号肽酶在N端附近切割;然后,Kex2p在多克隆位点的二元(Lys-Arg)信号稍上游切割;最后,Ste13p切割两次,除去2个Glu-Ala重复序列。

α-分泌信号来自S. cerevisiae,是一种通用的酵母分泌信号,已被用于许多种属酵母中,包括P. pastorisK. lactis等。

如果需要,可将Zeocin™抗生素涂布在YPD培养皿上层用于酵母筛选。已有一篇报道称,这种方法与10-15个3 mm玻璃微珠一起使用时非常有效。但是,建议进行一些优化,因为上层挥发会稀释抗生素的效力。

表达水平完全取决于蛋白本身。请参考EasySelect™使用手册第60页,其中列出了对多种蛋白的文献报道,包括所用酵母株类型和蛋白表达水平。该清单中的蛋白表达水平范围为每升0.001-12克。通过发酵,可达到更高的表达水平。

您可每天补充10%培养基体积的5%甲醇水溶液,从而再生成0.5%甲醇浓度。

Pichia能够正确组装具有四级结构的蛋白。乙型肝炎表面抗原是最早在Pichia中表达的蛋白之一,它被组装成其天然形式的22 nm颗粒。(参考文献:Cregg JM et al. (1987) High-level expression and efficient assembly of hepatitis B surface antigen in the methylotrophic yeast P. Pastoris. Nat Biotechnol 5:479–485.)考虑到颗粒组装问题,Cregg假设存在一个或多个对于颗粒形成很重要的翻译后事件相对于HbsAg蛋白合成发生较慢。因此,他使用生长速度更慢的MutS

将重组蛋白表达为分泌蛋白的主要优势是Pichia pastoris分泌的天然蛋白水平很低。因为在基本Pichia生长培养基中只有非常少量的蛋白质,这表示分泌的外源蛋白构成了培养基中总蛋白的绝大部分,作为蛋白质纯化的第一步。

注意:分泌蛋白将暴露于宿主细胞的糖基化体系中,如果蛋白质含有标准N-或O糖基化氨基酸共有序列,将可能被糖基化。

分泌蛋白将暴露于宿主细胞的糖基化体系中,如果蛋白质含有标准N-或O糖基化氨基酸共有序列,将可能被糖基化。

Pichia表达培养基中,不需要维持Zeocin™抗生素筛选,因为Pichia pastoris转化株是稳定的整合载体,已将目的基因稳定整合到基因组中。

为得到最佳的pPICZ-lacZ表达,我们建议参照以下指南:

1) 在BMGY培养基中,使20 毫升培养物生长至OD600为8.0。
2) 浓缩成5 毫升 BMMY。使用甲醇诱导。
3) 每天取时间点。
4) 收集细胞,并裂解于500 微升裂解液或SDS-PAGE样品缓冲液中。

加入5%氢氧化铵溶液,维持摇瓶中Pichia培养物的pH。发酵罐中使用28%浓缩形式。氢氧化铵也可作为Pichia细胞的氮源。

Pichia在(有氧)发酵的条件下,不会产生乙醇。甲醇的氧化代谢首先产生甲醛,甲醛随后被转变成二氧化碳。另一种有甲醛参与的同化作用循环,也不会产生乙醇。

酵母通常被认为可分泌蛋白酶。有些蛋白对于中性pH条件下具有活性的蛋白酶特别敏感。如果遇到这种情况,可以使用无缓冲型培养基进行表达。随着Pichia在无缓冲型培养基如MMH,(基本甲醇加组氨酸)中表达,pH降低至3或更低,使许多中性pH蛋白酶失活。尽管酸性培养环境会阻碍中性蛋白酶发挥活性,您仍然可在Pichia粗提液中加入浓度为1 mM的PMSF和EDTA(每隔几小时添加新的PMSF),并检测蛋白活性。详见Deutscher (1990)著《酶学方法》中的“蛋白纯化指南”。

相反,也有报道称,通过加入1%酪蛋白氨基酸(Difco)和缓冲液处理使培养基pH为6.0,可抑制细胞外蛋白酶,并提高小鼠表皮生长因子得率。详见Clare JJ et al. (1991) Gene 105:205–212.。

此外,较多的液泡蛋白酶可能是一个降解因素,特别是在含高细胞密度和少量细胞裂解液的发酵培养物中。使用缺乏这些蛋白酶的宿主酵母株,可能有助于减少降解。SMD1168和SMD1168H是蛋白酶缺陷型Pichia株,缺乏Pep4p,Pep4p是激活羧肽酶Y和蛋白酶B等其他液泡蛋白酶所需的一种蛋白酶。详见Higgins DR & Cregg JM (1998), Pichia Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey。请注意,您可从我们这里订购SMD1168、SMD1168H和Pichia Protocols书籍。

在以下参考文献中,使用了1%酪蛋白氨基酸: Clare JJ et al. (1991) Production of mouse epidermal growth factor in yeast: high-level secretion using Pichia pastoris strains containing multiple gene copies. Gene 105(2):205–212.

在这篇文章中,研究人员发现,尽管Pichia在YP和YNB中的生长密度相近,但在YNB中生长时,单拷贝转化子上清液中只有非常低水平的小鼠表皮生长因子(0.07 微克/毫升),并且该值在后续孵育中继续降低。使用经缓冲处理后pH为6.0的YNB培养基并补充1%酪蛋白氨基酸,单拷贝转化子的mEGF分泌水平大幅增加至1.9 微克/毫升左右。

不能,Pichia pastoris载体在Pichia methanolica中无效;Pichia pastorisPichia methanolica载体都具有来源于乙醇氧化酶的启动子,但不是同源的,因此,Pichia pastoris载体在Pichia methanolica中不能整合或复制。TEF1启动子在Pichia methanolica中可能有效。

AOX1基因表达产物的分子量为72 kDa(参考文献:Ellis SB, Brust PF, Koutz  PJ, Waters  AF, Harpold MM, Gingeras TR (1985) Isolation of Alcohol Oxidase and Two other Methanol Regulatable Genes from the Yeast, Pichia pastoris. Mol. Cell. Biol. 5: 1111-1121)。AOX2基因表达产物的分子量也是72 kDa。

某些酵母株可分泌蛋白毒素,抑制敏感病原体和酵母的生长。研究表明,毒素的产生取决于杀伤酵母中是否有线性双链DNA质粒。在酵母Pichia pastoris中,已鉴定出两种线性双链DNA质粒。下列已发表文章对P. pastoris的毒素生成能力进行了研究,在对14种不同的指示株进行测试时,未检测到杀伤活性。

参考文献:Banerjee and Verma (2000) Search for a Novel Killer Toxin in Yeast Pichia pastoris. Plasmid 43:181­183. 

我们的实验方案使用的是粗制细胞溶解酶。纯品较贵,也没有必要使用。在该实验方案中,我们通常使用酵母裂解酶进行细胞裂解(5 微升的1 毫克/毫升储液)。这是过量的,但效果很好。参考文献:BioTechniques 20:980–982, June 1996.

500单位的细胞溶解酶与1单位的酵母裂解酶效果相近。为了裂解1 毫升的Pichia细胞用于PCR分析,需使用总共25单位的细胞溶解酶,而酵母裂解酶只需0.05单位。酵母裂解酶有不同纯度。20T酵母裂解酶即能够满足所有用途。没有必要使用纯度更高的100T。

可以,您可将ProBond™系统用于Pichia表达的His标签蛋白。以下是关于使用ProBond™系统纯化Pichia上清液的一些建议:

  1. 调整Pichia上清液的pH至7.5–8.0。
  2. 从白色沉淀物中倒出上清液。建议保留沉淀,当表达蛋白发生共沉淀时可将沉淀重新溶解,但这种情况较罕见。
  3. 离心上清液,除去残留的细胞碎片或其他可能堵塞柱子的物质。
  4. 加盐,将电导率调整至与500 mM NaCl的电导率相同(可能不需要这样做,因为Pichia培养基是高盐的)。
  5. 按照使用手册的指示过柱。

在非还原型SDS-PAGE凝胶上,HSA将在55 kD;在还原型SDS-PAGE凝胶上,将在66 kD。

Pichia酵母株和转化

以下是我们提供的Pichia酵母株及其基因型和表型:

Pichia pastoris 酵母株

蛋白酶野生型酵母株 基因型 表型 应用
X-33 野生型 Mut+ His+ 筛选Zeocin™抗生素抗性表达载体
GS115 his4 Mut+ His- 筛选含HIS4的表达载体
KM71H aox1::ARG4, arg4 MutS His+ 筛选Zeocin™抗生素抗性表达载体,生成MutS表型酵母株
蛋白酶缺陷型酵母株 基因型 表型 应用
SMD1168 his4, pep4 Mut+ His- 在无蛋白酶A活性的酵母株中筛选含HIS4的表达载体
SMD1168H pep4 Mut+ His+ 在无蛋白酶A活性的酵母株中筛选Zeocin™抗生素抗性表达载体

PichiaPink™ 酵母株

蛋白酶野生型酵母株 基因型 表型 应用
PichiaPink™酵母株1 ade2 (ura5Δ::ScSUC2 ade2Δ::lacZ-URA5-lacZ) Mut+ Ade2- 对PichiaPink™表达载体进行粉色/白色筛选
蛋白酶缺陷型酵母株 基因型 表型 应用
PichiaPink™酵母株2 ade2, pep4 (ura5Δ::ScSUC2 pep4Δ::lacZ ade2Δ::lacZ-URA5-lacZ) Mut+ Ade2- 在无蛋白酶A活性的酵母株中对PichiaPink™表达载体进行粉色/白色筛选
PichiaPink™酵母株3 ade2, prb1 (ura5Δ::ScSUC2 prb1Δ::lacZ ade2Δ::lacZ-URA5-lacZ) Mut+ Ade2- 在无蛋白酶B活性的酵母株中对PichiaPink™表达载体进行粉色/白色筛选
PichiaPink™酵母株4 ade2, prb1, pep4 (ura5Δ::ScSUC2 pep4Δ::lacZ prb1Δ::lacZ ade2Δ::lacZ-URA5-lacZ) Mut+ Ade2- 在无蛋白酶A和B活性的酵母株中对PichiaPink™表达载体进行粉色/白色筛选

我们建议在收到后,将Pichia酵母株穿刺培养物保存在4°C。长期保存时,我们建议在收到后立即将其制备成甘油储液(15%甘油)并保存于–80°C。甘油储液可长期保存(除非经过多次冻融)。在制备甘油储液时,我们建议使用过夜培养物并浓缩2-4倍。将细胞离心,并使用25–50%原始体积的甘油/培养基重悬。最好使用新鲜培养基加甘油冻存细胞,而不仅仅是将甘油加到过夜培养物中这么简单。

我们只提供一种MutS Pichia酵母株,即KM71H,货号C18200。我们以前提供的KM71已停产。

KM71H的优势是无需在甲醇基本培养基上对Mut表型进行筛选。所有转化株都是MutS。在某些情况下,MutS酵母株可产生比Mut+酵母株更高的表达水平。

Pichia pastoris最常以无性单倍体的形式存在。在氮源限制的条件下,可能出现交配并形成二倍体细胞。由于相同株的细胞易于相互交配,P. pastoris在定义上是同宗配合的。相对于异宗配合的Saccharomyces cerevisiae,P. pastoris的单倍体状态更稳定。在氮源限制的条件下,P. pastoris二倍体可发生减数分裂产生含四个单倍体孢子的子囊。

Pichia pastoris中有两个基因编码乙醇氧化酶——AOX1和AOX2。AOX1基因表达产物占据细胞中大部分的乙醇氧化酶活性。AOX1基因表达可被甲醇严格调控,并且诱导后可达到非常高的水平。在甲醇培养基上生长的细胞中,AOX1蛋白通常占可溶性蛋白总量的30%以上。虽然AOX2与AOX1约有97%同源性,但在甲醇培养基上的生长速度比AOX1慢很多。AOX1基因丢失,会导致细胞的大部分乙醇氧化酶活性缺失,从而生成MutS(methanol utilization slow)表型的酵母株。MutS酵母株具有突变的aox1位点,但AOX2是野生型的。MutS酵母株代谢甲醇的能力降低,因此,在甲醇培养基上生长缓慢。MutS过去被称为Mut–。Mut+(methanol utilization plus)表示野生型酵母株具有代谢甲醇并将其作为唯一碳源的能力。Mut+和MutS这两种表型可用来检测目的基因在Pichia转化体中的整合。

我们提供多种酵母株,使您能够测试并确定哪一种最适用于您的特定蛋白。建议至少要测试一种Mut+和一种MutS酵母株。

我们所有的Pichia酵母株都是同宗配合株。这表示,每一代实际上可转换交配型。在Saccharomyces酵母株中,这会导致培养物迅速完全变为二倍体。相反,Pichia pastoris酵母株不能有效交配形成二倍体。因此,在任何给定的时间内,群体中的细胞既有“a”又有“α”交配型。

将GS115/pPICZ/lacZ、GS115/Albumin和GS115在含组氨酸的基本培养基上划线。以甲醇为碳源。GS115和GS115/pPICZ/lacZ在甲醇培养基上生长迅速。GS115/Albumin在甲醇培养基上生长非常缓慢。根据生长速度的不同,可确认GS115/pPICZ/lacZ是一种Mut+酵母株,而GS115/Albumin是一种MutS酵母株。在培养皿中加入新鲜组氨酸对于实验的成功至关重要。

蛋白酶A是一种液泡天冬氨酰蛋白酶,可自我激活并随后激活其他的液泡蛋白酶,如羧肽酶Y和蛋白酶B。在蛋白酶A介导的蛋白酶解过程发生之前,羧肽酶Y完全失活;据报道,蛋白酶B(由S. cerevisiae的PrB基因编码)的前体形式(即,在蛋白酶A介导的酶解过程发生前的存在形式)具有50%左右的生物活性。目前,对Pichia pastoris蛋白水解活性的了解很少。为了使酵母株同源蛋白水解活性失活或缺失,制备了蛋白酶缺陷型Pichia pastoris酵母株:

SMD 1168: Pep4基因功能丧失
PichiaPink™ 酵母株2: Pep4基因功能丧失
PichiaPink™ 酵母株3: Prb1基因功能丧失
PichiaPink™ 酵母株4: Prb1, Pep4基因功能丧失

Pep4缺陷型突变缺乏蛋白酶A、羧肽酶Y的蛋白酶活性,约有一半的蛋白酶B活性。Prb1缺陷型突变缺乏蛋白酶B活性。Pep4/PrB缺陷型突变缺乏所有这三种酶的蛋白水解活性:蛋白酶A、羧肽酶Y和蛋白酶B。与蛋白酶野生型Pichia酵母株相比,这些蛋白酶缺陷型酵母株已被证明是生产蛋白水解敏感性产物的高效表达系统。

以下是不同的Pichia转化方法:

Pichia EasyComp™转化试剂盒:易于使用的即用型试剂

该方法可产生化学感受态Pichia细胞,是一种替代电穿孔的快速、方便的方法。转化效率低(使用3 微克线性质粒DNA转化50 微升感受态细胞,得到约50个菌落),因此难以分离多拷贝整合体。与使用新鲜制备的细胞相比,使用冻存细胞可得到更高的转化效率。

PEG 1000转化法:简单、自己动手的实验方案

一定要在冻存细胞样品中加入DNA,因为细胞复苏后,活力降低非常快——即使是在冰上复苏。为了进行多个转化实验,建议分组处理,每次6个。用于转化时,PEG法通常比LiCl更好,但转化效果不如原生质球或电穿孔法。但是,该方法对于不具备电穿孔设备的人来说很方便。转化效率为102-103个转化株/毫克 DNA。

氯化锂转化法:简单、自己动手的实验方案

该方法是电穿孔转化法的替代方法。感受态细胞必须新鲜制备。转化效率为102-103个转化株/微克 线性DNA。

注意:醋酸锂对Pichia pastoris无效。只能使用氯化锂。

电穿孔:简单、高效,自己动手的实验方案;不会破坏细胞壁

感受态细胞必须是新鲜制备的。转化效率为103-104个转化株/微克线性DNA

Pichia原生质球试剂盒:消化细胞壁,使DNA进入细胞;实验步骤包括使用酵母裂解酶处理细胞,从而建立原生质球。

您必须随着时间增加,读取不同时间点的OD600值而确定使用酵母裂解酶进行处理的最佳时间。酵母裂解酶孵育时间过长会导致转化效率降低。将原生质球与DNA结合并接种。转化效率103-104个转化株/微克线性DNA。

注意:不建议将原生质球用于转化带有抗生素抗性标记物的Pichia载体。细胞壁损坏可导致细胞对抗生素的敏感性增强,使假定的转化株在抗生素抗性基因表达前发生死亡。相反,原生质球可用于PichiaPink™载体的转化,因为这些载体是利用营养缺陷型标记物进行筛选的。

我们建议使用电穿孔法转化Pichia。采用电穿孔法,每微克线性化DNA可产生103-104个转化株,并且不会破坏Pichia的细胞壁。如果您没有电穿孔设备,则可使用Pichia原生质球试剂盒(货号K172001)、PEG 1000实验方案(使用手册第78页)、LiCl实验方案(使用手册手册第80页)或Pichia EasyComp™转化试剂盒(货号K173001)。我们不建议使用原生质球将含有抗生素抗性标记物的质粒转化到Pichia。细胞壁损坏可导致细胞对抗生素的敏感性增强,使假定的转化株在抗生素抗性基因表达前发生死亡。相反,原生质球用可用于PichiaPink™载体的转化,因为这些载体是利用营养缺陷型标记物进行筛选的。

Pichia EasyComp™试剂盒可产生化学感受态Pichia细胞,是一种快速、方便的转化方法,可替代电穿孔。但是,由于该试剂盒转化效率低(3 微克质粒DNA可产生约50个菌落),因此难以分离出多拷贝整合体。在需要多拷贝整合体的情况下,为获得最佳结果,请使用电穿孔法。

注意:用于电穿孔的细胞需要使用不同的制备方法。不要将使用EasyComp™实验方案制备的细胞用于电穿孔。

如果您非常想要从Pichia中分离目的基因的多拷贝整合体,那么我们强烈建议使用电穿孔法。多拷贝插入概率为1-10%,需要成百上千个转化株才能分离得到可满足表达检测所需数量的多拷贝克隆。电穿孔在Pichia中可产生一些最高的转化频率,是分离多拷贝整合体的可选方法。

我们建议尝试使用体内和体外两种方法,生成或分离目的基因的多拷贝整合体。很难事先预测哪种方法的效果更好。下表总结了两种方法的优缺点:


                                                                    体外方法(pAO815)

优点

缺点

  • 定量——构建固定数量的多聚体
  • 大多数His+转化株含有适当固定数量的插入片段
  • 易于分离带有多个插入片段的重组体,因为大多数His+转化株包含多拷贝数的目的基因
  • 体外构建可实现对蛋白表达拷贝数影响的逐步分析
  • 多个插入片段位于同一个位点
  • 载体中无需第二个药物抗性标记物
  • 克隆固定数量的多聚体之前,需要更多的准备工作
  • 载体可能会变得很大,这取决于基因的大小和产生的拷贝数多少
  • 大肠杆菌中可能发生重排

 

体内方法(pPIC3.5K和pPIC9K)

优点

缺点

  • 易于开始试验,因为在转化到Pichia中之前,只有1拷贝的基因被克隆到载体中
  • 确定1-10%自发生成的His+转化株具有多拷贝插入
  • 载体的平均大小与其他Pichia表达载体相近
  • 多个插入片段位于同一个位点

 

  • 定性筛选——Geneticin抗性与目的基因的拷贝数不一定有必然联系
  • 筛选His+转化株可能涉及更多工作,因为您需要成千上万个His+转化株才能获得足够用于检测的Geneticin抗性菌落
  • 多插入片段的数量未知(但是可通过Southern或点印迹分析法确定)
  • Geneticin筛选对细胞密度敏感,可能导致假阳性

尽管PEG3350已被成功用于内部使用,但PEG 4000的酵母转化效果可能是最好的。

在YPD培养皿中加入1 M山梨醇,可稳定经电穿孔的细胞,因为这些细胞对渗透压有些敏感。

以下实验方案已被多次用于Pichia pastoris。该方案使用250 mL培养物,并最终浓缩至1 mL。

  1. 将Pichia酵母株接种于10 mL YPD培养基中,30°C震荡过夜生长。
  2. 第二天早晨,检测OD600。为了使细胞在下午达到对数生长期,应稀释细胞使OD600在下午4点或5点约为3.0。
  3. 当OD600达到3.0左右,将250 微升培养物接种到250 毫升YPD培养基中。目的是为了在第二天早晨获得健康的对数期细胞,OD600约为1.0。
  4. 如果OD600约为1.0,则将细胞置于1L的瓶中以3K rpm离心10分钟。
  5. 轻轻重悬于250 mL预冷的dH20。
  6. 转移到500 毫升离心瓶中,以3K rpm离心10分钟。重复操作。
  7. 重悬于20 mL预冷的1 M山梨醇中,并转移至50 mL离心管中。
  8. 以3K rpm离心10分钟。
  9. 重悬于1 mL的1M山梨醇中,置于冰上。
  10. 每次电穿孔使用80 µL宿主酵母株。

Pichia发酵

我们不提供任何Pichia发酵实验方案。请参考我们网站中名为“Pichia发酵指南”的文档。

甲醇营养型、高细胞密度的Pichia发酵上清液变绿,是因为乙醇氧化酶(Aox1p)。Aox1p组装到同源八聚体中并结合黄素腺嘌呤二核苷酸,在体内作为酶的辅基。在高浓度下,该酶可形成类晶体,产生绿色发色团。当Pichia细胞在甲醇上生长时,多达30%的总细胞蛋白是Aox1p。尽管Aox1p不是分泌酶,但会由于细胞泄露或者细胞裂解,从而在培养物上清液中累积。

在其他碳源培养基上,如甘油或葡聚糖,Pichia可生长至同样高的细胞密度,并且不会产生这种颜色改变。这些条件不会诱导或会严格抑制乙醇氧化酶的生成。

为了成功纯化蛋白质,去除Aox1p(和FAD),您可使用S柱(逆向阳离子交换柱)或Q柱(Sepharose Fast Flow离子交换柱)。当Q柱的直径和柱长较大时,Q株才会像S柱一样有效。在ProBond™树脂上纯化His标签蛋白,也能有效去除Aox1p。

Pichia发酵过程中,细胞生长所能承受的最高pH为8-8.5。

大多数研究人员喜欢使用MAZU DF 204或KFO 673。也可使用Antifoam 289,但它的持续时间不长。使用最少量的消泡剂控制发泡。一个健康的的5 升发酵体系仅需要0至几毫升的消泡剂。最好使用易于操控的消泡控制器加入消泡剂。如果培养物泡沫过多,可能是由于碳源有限、低pH或培养物不健康。

Pichia发酵过程中,氮源是用于调节pH的氢氧化铵。基础或微量盐培养基不含氮。

这取决于克隆是Mut+还是MutS。

对于Mut+克隆,起始阶段(诱导的前2-4小时)的培养物耗氧速率低于甘油分批发酵阶段末期。当培养物适应了甲醇后,若培养物健康(即,未被过多的甲醇毒害),则耗氧速率将显著提高。在Mut+克隆发酵期间,应进行甲醇峰值测试。

对于MutS克隆,在发酵过程的大部分时间里,耗氧速率都将低于甘油分批发酵阶段末期。实验人员应非常小心,不要毒害MutS克隆

您无需在Pichia发酵培养基中加入任何酸。健康的培养物会使培养基酸化。如果培养物pH在升高,则表示碳源耗尽或培养物不健康。

使用混合补料主要是为了降低对Pichia不利的蛋白的表达水平。我们通常将混合补料用于MutS克隆。目的就是保持培养物处于生长活力旺盛的状态,从而“乐于”表达蛋白。

可以。细胞在YPD中能够良好生长,但存在两个缺点:在营养更丰富的YPD中,很难控制发泡,并且难以从培养基中纯化分泌蛋白。BMGY配方可解决这两个问题。

您无需在PTM1微量盐或发酵培养基中加硫酸。这样做除了可能帮助盐溶解,不会产生任何其他作用。

不建议使用抗生素,因为在Pichia发酵期间,大部分抗生素会在低pH的培养基中失活。也就是说,加入氨苄青霉素或卡那霉素等抗生素,并不会损害发酵过程,但抗生素会因为低pH条件而失活,甚至沉淀出来。为得到最佳结果,应使用良好的无菌技术。

不能,您不能对甲醇进行高压灭菌。有两种方法可解决该问题,一定程度上取决于生物反应器的大小和使用体积。您可将甲醇稀释到工作浓度,并用适用于乙醇的过滤器进行过滤除菌,或者您可以假设甲醇是无菌的(本应该是无菌的)并将其直接稀释到无菌水中。氢氧化铵溶液也不可以进行高压灭菌。您可以假设30%储液是无菌的(没有生物能在该溶液中存活),并使用无菌水将其稀释至工作浓度。

pGAP克隆可使用以下高细胞密度实验方案。加入碳料,直至达到所需的细胞密度(细胞湿重(WCW)为300-400 克/升)。如果发酵罐中的蛋白状态良好,可增加至300–400 克/升 WCW,与甲醇诱导型克隆相似。在发酵后48小时内,可达到该密度。我们已经使用这些方案,使组成型表达载体在甘油中进行发酵,并得到良好的结果。您可能需要对发酵基础盐培养基做以下改进:

1) 在分批发酵培养基中,用2%葡聚糖代替4%甘油。
2) 在补料生长培养基中,用40%葡聚糖代替50%甘油。
3) 以12 毫升/升/小时的速度补加40%葡聚糖(Jim Cregg已经发表使用多种碳源作为底物进行表达的数据;葡聚糖带来最高表达水平)。
4) 可在培养基中加入酵母提取物和蛋白胨,维持蛋白稳定性。

警告:如果您在使用His-酵母株,使用pGAPZ转化后,酵母株依然是His-标记的。使用基本培养基发酵时,需要在发酵罐中加入组氨酸。

Saccharomyces cerevisiae表达系统

以下是用于S. cerevisiae转化的不同方法:

  • S. cerevisiae EasyComp™转化试剂盒:易于使用的即用型试剂
    • 感受态细胞可冻存。转化效率高于103转化株/微克 DNA。与使用新鲜制备的细胞相比,使用冻存细胞可得到更高的转化效率。
  • 小规模酵母转化实验方案(见使用手册第13页)
  • 醋酸锂转化:简单、自己动手的实验方案
    • 感受态细胞必须是新鲜制备的
  • 电穿孔:简单、高效,自己动手的实验方案
    • 感受态细胞必须是新鲜制备的
  • 原生质球试剂盒:高效,工作量大,不适用于抗生素筛选

注意:选择适当的接种密度。菌落将在几天内出现。不要挑选最大的菌落,因为它们通常为抑制子。

 

转化效率很大程度上取决于酵母株,范围为1000-100,000个转化株/微克 DNA。

OD600值为0.1,约等于3 x 106细胞/毫升

TE、醋酸锂和PEG的储液可保存。但是,制备待转化细胞的混合溶液,必须每次现用现配。如果溶液不是新配制的,则可能损失转化效率。

我们提供INVSc1酵母株。这是一种二倍体酵母株,仅作表达用途。该酵母株不能形成良好的孢子,因此不适用于酵母遗传研究。INVSc1酵母株的基因型和表型如下:

基因型:MATa his3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52/MATα his3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52

表型:His-, Leu-, Trp-, Ura-

注意:INVSc1缺乏组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶。该酵母株在缺乏组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的SC基本培养基中不能生长。

trp1-289突变是一种TRP-1基因的点突变,可导致该酵母株色氨酸营养缺陷(即,该酵母株的生长培养基中需要含有色氨酸)。许多载体含有TRP1基因的野生型拷贝,能够补偿trp1-289突变表型,从而可作为这些载体的筛选标记物。trp1-289突变与trp1完全缺失突变的表型相似,但是,与trp1-289不同,trp1完全缺失的酵母株不能被半乳糖有效诱导。因此,使用半乳糖诱导时,最好使用trp1-289突变株。但是,由于trp1-289突变株存在可检测频率的恢复,所以一定要对您的克隆进行验证。

在诱导期间,一些研究人员选择使酵母生长在以2%半乳糖作为唯一碳源的培养基中。但是,在含2%半乳糖和2%棉籽糖的诱导培养基中,酵母通常生长更快。棉籽糖是酵母的良好碳源,与葡萄糖不同,棉籽糖不会抑制GAL启动子的转录。棉籽糖是由半乳糖、葡萄糖和果糖依次连接而形成的三糖。大部分酵母可切割葡萄糖-果糖键,但不会切割半乳糖-葡萄糖键。果糖随后被用作碳源。

我们可提供pYES-DEST52(货号12286019),它是唯一一种Gateway兼容的酵母表达载体。该载体专为在Saccharomyces cerevisia中实现高水平的半乳糖诱导型表达而设计。

是的,我们提供pYES2.1/V5-His-TOPO载体,它是pYES2.1 TA表达试剂盒(货号K415001)的一部分,可将Taq聚合酶扩增的PCR产物直接克隆到Saccharomyces cerevisiae中并利用半乳糖调控其表达。

当α因子基因中的P因子被替换为α时,S. pombe不能生成P因子。但是,当P因子基因中的α因子被替换为P时,S. pombe能够生成α因子。有反面证据表明,S. pombe能够加工其自身的交配因子切割位点,但并不是S. cerevisiae α因子的所有切割位点。最好使用一个更通用的信号序列(而不是前导信号序列,如α)。如果必须走前导路线,最好使用S. pombe的P因子前导而不是S. cerevisiae的α前导。

酵母生长培养基

以下是用于培养Pichia pastorisS. cerevisia的营养丰富型和基本培养基:

营养丰富型培养基:

适用于S. cerevisiaePichia pastoris

  • YPD(YEPD):酵母提取物、蛋白胨和葡聚糖
  • YPDS:酵母提取物、蛋白胨、葡聚糖和山梨醇

仅适用于Pichia pastoris

  • BMGY:缓冲型甘油复合培养基
  • BMMY:缓冲型甲醇复合培养基

基本培养基(又名缺陷型培养基):

适用于S. cerevisiae

  • SC(SD):完全合成培养基(YNB、葡聚糖(或棉籽糖或半乳糖)以及氨基酸)

适用于Pichia pastoris

  • MGY:基本甘油培养基
  • MD:基本葡聚糖培养基
  • MM:基本甲醇培养基
  • BMGH:缓冲型基本甘油培养基
  • BMMH:缓冲型基本甲醇培养基

可以,含硫酸铵且无氨基酸的YNB培养基可通过高压蒸汽灭菌。

在货号为Q30007的包装中,每包所含试剂可制备500 毫升用于Pichia 培养基的10X YNB,或1,000 毫升用于S. cerevisiae培养基的10X YNB(因为Pichia 培养基的用量是S. cerevisiae培养基的2倍)。以下是1X YNB的配方:

硫酸铵

5 g

生物素

0.002 mg

泛酸钙

0.4 mg

叶酸

0.002 mg

肌醇

2 mg

盐酸

0.4 mg

对氨基苯甲酸

0.2 mg

盐酸吡哆辛

0.4 mg

核黄素

0.2 mg

盐酸硫胺素

0.4 mg

硼酸

0.5 mg

硫酸铜

0.4 mg

碘化钾

0.1 mg

六水三氯化铁

0.2 mg

一水硫酸锰

0.4 mg

二水钼酸钠

0.2 mg

一水硫酸锌

0.4 mg

磷酸二氢钾

1 g

硫酸镁

0.5 g

氯化钠

0.1 g

氯化钙

0.1 mg

细菌用-胰蛋白胨和细菌用-蛋白胨是两种不同的特定类型蛋白胨。细菌用胰蛋白胨是一种稍差的氮源,更多的氮是由酪氨酸和色氨酸提供的。将它们作为Pichia生长培养基的组分进行比较时,生长曲线会稍有不同,但差异很小。在以酵母氮源基础作为主要氮源的Pichia培养基配方中,如BMGY和BMMY,差异非常小或无差异。

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