サブトラクティブハイブリダイゼーション

サブトラクティブハイブリダイゼーションは、特異的な組織、細胞タイプ、あるいは特異的段階における遺伝子発現研究において強力な技術です。 従来の手順の多くは、mRNAを多量に必要とし、偽陽性や再現不可能な結果を得る可能性が高い、技術的要求が厳しく、手間のかかる手法です。

Solid-phase cDNA
Dynabeads® Oligo(dT)₂₅ can be used to produce subtracted cDNA probes for screening and isolation of rare, differentially expressed mRNAs. 捕捉したmRNAをビーズから溶出することなく、ビーズ結合オリゴdT配列を用いて cDNA合成を行い、特定の細胞種や組織に応じた固相cDNAライブラリーを調製することができます（1-11）。

Advantages
A simplified, fast and reliable method for generating subtracted probes or subtracted cDNA libraries
Only small amounts of sample/mRNA are required
Magnetic handling minimises losses at each step
Specific mRNAs are highly enriched
Magnetic handling enables simple and rapid buffer changes to optimise conditions for hybridisation and specific enzymatic reactions
The subtractor Dynabeads® can easily be regenerated, stored and reused.

Method I
mRNA from the target material is hybridized with first-strand cDNA from the subtractor material immobilised on Dynabeads®. ビーズに結合したサブトラクティブcDNAで捕捉したmRNAをマグネットで分離することによって、サブトラクトされたmRNAが上澄み液中に残ります。サブトラクションに使用したビーズは、再使用ができます。 最終ハイブリダイゼーション段階が終了した後、サブトラクション固有mRNAに対して逆転写反応を行い、放射性標識cDNAを合成し、cDNAライブラリーのスクリーニング（5、10）やcDNAクローニング（9）に使用できます。 サブトラクション用のmRNA群と標的mRNA群との違いがわずかである場合には、標的mRNAを大量に得ることは難しく、Lambert（11）によるPCRを用いる方法が妥当となります。 作用メカニズムについては、 こちらの図をご参照ください。


Method II
An alternative approach is to create immobilised cDNA libraries from both target and subtractor mRNA (2, 4). 標的cDNAのランダムプライミングにより第2鎖cDNAを合成し、断片を溶出して、大量の固相化したサブトラクション用cDNAと混ぜ合わせます。 通常の断片はアニーリングを起こして除去されますが、上澄み液中に残った断片をプローブとして使用して、cDNAライブラリーのスクリーニングを行うことができます（2、8）。mRNA量が限られている場合や二種類のmRNA源の類似性が高い場合には、サブトラクションのステップを複数回実施するために必要な試料がないことも考えられます。また、スクリーニングを行うためには、試料の量が不十分であることも考えられます。 このような問題は、サブトラクションしたcDNA断片を固相化したサブトラクション用cDNAに対して再アニーリングさせる方法により解決できます。 生成した二重鎖cDNAを切断し、リンカーのライゲーションを行い、PCRにより断片を増幅します（3）。 作用メカニズムについては、 こちらの図をご参照ください。


主な参考文献:

1. _{Camerer E et al. Binding of Factor VIIa to tissue factor on keratinocyte induces gene expression.J. Biol. Chem 2000;275(9):6580-6585.}
2. _{Rodriguez IR and Chader GJ. A novel method for the isolation of tissue-specific genes. Nucl.Acids.Res.1992;(13):3528.}
3. _{CocheT, Dewez M and Beckers M-C. Generation of an unlimited supply of a subtracted probe using magnetic beads and PCR. Nucl Acids Res. 1994;22(7):1322-1323.}
4. _{Schoen TJ et al. Isolation of candidate genes for macular degeneration using an improved solid-phase subtractive cloning technique. Biochem.Biophys.Res.Commun.1995; 21(1)181-188.}
5. _{Aasheim H-C, Logtenberg T and Larsen F. Subtractive hybridization for the isolation of differentially expressed genes using magnetic beads. Meth Mol. Biol. 1996; 69:115-128.}
6. _{Leygue ER, Watson PH and Murphy LC. Identification of differentially expressed genes using minute amounts of RNA. BioTechniques 1996;21(6):1008-1012.}
7. _{Hampson N, Hampson L and Dexter TM. Directional random oligo-nucleotide primed (DROP) global amplification of cDNA: its application to subtractive cDNA cloning. Nucl Acids Res. 1996;24 (23): 4832-4835.}
8. _{Schraml P, Shipman R, Stulz P, Ludwig CU. cDNA subtraction library construction using a magnet-assisted subtraction technique (MAST). Trends Genet 1993;9:70-71.}
9. _{Sharma P, Lönneborg A, Stougaard, P. PCR-based construction of subtractive cDNA library using magnetic beads. BioTechniques 1993;15(4):610-611.}
10. _{Aasheim H-C, Deggerdal A, Smelang EB, Hornes E. A simple subtraction method for the isolation of cell-specific genes using magnetic monodisperse polymer particles. BioTechniques 1994;16(4):716-721.}
11. _{Lambert KN and Williamson VM. DNA library construction from small amounts of RNA using paramagnetic beads and PCR. Nucleic Acid Res 1993;21:775-776.}