HCS- und HCA-Beispieldaten

Das High-Throughput-Immunassay-Screening wird mit den neuen CellInsight CX7 Pro Plattformen ermöglicht

Vergleich des FirePlex™-HT No-Wash-Immunassays mit den CellInsight CX7 und CX7 Pro Geräten. Der für das High-Throughput-Screening optimierte No-Wash FirePlex Assay wurde gemäß dem Herstellerprotokoll zum Nachweis von 5 bzw. 10 Analyten pro Well durchgeführt. Zur Untersuchung der Reproduzierbarkeit der Analyten und der Fenster für den dynamischen Bereich wurde eine 10-Punkt-Standardkurve quantifiziert. Der resultierende Assay wurde entweder mit der CellInsight CX7 (Bilder links) oder der CX7 Pro (Bilder rechts) Plattform bestimmt und mithilfe der FirePlex Analysis Workbench Software quantifiziert. Nur das CX7 Pro Gerät (Bilder rechts) konnte einen dynamischen Bereich von 2,5 (15 Bit) oder 3,0 (16 Bit) überschreiten und weniger als 15 Prozent Intraplatten-Variationskoeffizienten erreichen. Die überlegene Optik und die 95%-QE-Detektionsfähigkeit des CX7 Pro Geräts sorgen für einen deutlich verbesserten dynamischen Bereich und eine deutlich verbesserte Reproduzierbarkeit. Die Validierung dieses Experiments erfolgte durch Abcam™ mithilfe der CX7 Pro sCMOS Kameramodi 15 Bit und 16 Bit zur Berücksichtigung von HT-Screening-Überlegungen.

Immunonkologische Anwendung:  Bildgebende antikörperabhängige Inaktivierung von Zellen in Brustkrebssphäroiden

Antikörperabhängige Inaktivierung von Zellen in Brustkrebssphäroiden. Humane natürliche Killerzellen wurden mit dem Dynabeads Untouched Human NK Cells Kit isoliert und mit CellTracker Deep Red Dye gekennzeichnet. Humane Brustkrebszellen (SKBR3) wurden über Nacht in Nunclon Sphera 96-Well-Platten zu Sphäroiden gezüchtet, die mit dem Anti-HER2-Antikörper Trastuzumab behandelt wurden, und dann 4 Stunden lang mit NK-Zellen angesetzt. Die Zellen wurden mit CellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagent und Hoechst 33342 gefärbt und auf dem CellInsight CX7 LZR High-Content-Screening abgebildet. Plattform. Bei den Bildern handelt es sich um eine maximale Intensitätsprojektion mehrerer Z-Schnitte. CellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagent wurde zur Untersuchung von NK-Zell- und Antikörper-vermittelter Apoptose in Sphäroiden verwendet. CellTracker Deep Red wurde zur Verfolgung von NK-Zellen innerhalb des Sphäroids eingesetzt. Trastuzumab, das an HER2 in SKBR3-Zellen gebunden ist, verstärkt die Anti-Tumor-Reaktion der NK-Zellen über antikörperabhängige zelluläre Apoptose.

Anwendung zur Sphäroid-Bildgebung und -Analyse: Segmentierung und Quantifizierung der EdU-Proliferation und der Sphäroidgröße

Segmentierung und Quantifizierung von EdU und Sphäroid-Größe mit dem CellInsight CX7 LZR System. A549-Zellen wurden mit einer Dichte von 5.000 Zellen pro Well auf einer Nunclon Sphera 96U-Well-Mikrotiterplatte ausgestrichen und 24 Stunden lang in einem CO2-Inkubator inkubiert. EdU wurde bei einer Endkonzentration von 10 µM hinzugefügt und 1 Stunde lang inkubiert. Die Sphäroide wurden anschließend gewaschen, mit 4 % Formaldehyd fixiert und mit 0,25 % Triton X-100 permeabilisiert. Die Sphäroide wurden dann für EdU mit dem Click-iT EdU Alexa Fluor 488 HCS Assay Kit gemäß dem Kit-Protokoll gefärbt. Die Platte wurde mit einem 4-fachen Objektiv im Konfokalmodus auf einer CellInsight CX7 LZR High-Content-Screening-Plattform abgebildet. Das Bild ist eine maximale Intensitätsprojektion von 200 optischen Z-Scheiben mit jeweils 1 Mikrometer. Die Quantifizierung wurde mit der HCS Studio 2.0 Software über die Morphology Explorer BioApplication durchgeführt. Das Sphäroid wurde als ein Objekt segmentiert, und EdU-positive Zellen wurden als Punkte innerhalb des Sphäroids gezählt. Mit der Morphology Explorer BioApplication wurden die Sphäroide als ganzes Objekt segmentiert, EdU-positive Zellen wurden innerhalb des Sphäroids segmentiert und die Anzahl der Zellen wurde dargestellt.

Konfokalbildgebung von 3D-Sphäroiden im Lebendzell-Modus für Bio-Anwendungen

Konfokalbildgebung von 3D-Sphäroiden im Lebendzell-Modus. (A) A549-Zellen wurden mit einer Dichte von 5.000/Well auf einer U-Bodenplatte ausgestrichen und 48 Stunden lang in einem CO2-Inkubator inkubiert. Lebende Sphäroide wurden mit einem LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit für lebende und tote Zellen gekennzeichnet. Die Platte wurde automatisch mit einem 10-fachen Objektiv mit Konfokalbildgebung auf einem CellInsight CX7 LZR HCS-Gerät abgebildet. Bei diesem Bild handelt es sich um eine maximale Intensitätsprojektion mehrerer Z-Schnitte. Tote Zellen, die gefärbt wurden, wurden im Sphäroidkern (rot) und lebenden Zellen (grün) an der Peripherie von Sphäroiden beobachtet. (B) A549-Zellen wurden mit einer Dichte von 5.000/Well auf einer U-Bodenplatte ausgestrichen und 24 Stunden lang im CO2-Inkubator inkubiert. Lebende Sphäroide wurden dann mit MitoTracker Orange CMTMRos und CellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagent 30 min lang gefärbt. Die Platte wurde automatisch mit einem 10-fachen Objektiv mit Konfokalbildgebung auf einem CellInsight CX7 LZR HCS-Gerät abgebildet. Bei diesem Bild handelt es sich um eine maximale Intensitätsprojektion mehrerer Z-Schnitte. Bei lebenden A549-Sphäroiden sind die meisten Zellen gesund, wie bei der MitoTracker Orange-Färbung zu sehen ist, und es wurden nur sehr wenige apoptotische Zellen beobachtet. (C) A549-Zellen wurden mit einer Dichte von 5.000/Well auf einer U-Bodenplatte ausgestrichen und 24 Stunden lang in einem CO2-Inkubator inkubiert. Lebende Sphäroide wurden dann mit dem Image-iT Green Hypoxia Reagent30 min lang gefärbt. Die Platte wurde automatisch mit einem 10-fachen Objektiv mit Konfokalbildgebung auf einem CellInsight CX7 LZR HCS-Gerät abgebildet. Bei diesem Bild handelt es sich um eine maximale Intensitätsprojektion mehrerer Z-Schnitte. Lebende A549-Sphäroide zeigen eine Hypoxie-Färbung, wie bei der Färbung mit dem Image-iT Green Hypoxia Reagent. (D) SKBR3-Zellen wurden mit einer Dichte von 5.000/Well auf einer U-Bodenplatte ausgestrichen und 24 Stunden lang in einem CO2-Inkubator inkubiert. Lebende Sphäroide wurden dann 24 Stunden lang mit einem mit pHrodo Red konjugierten Herceptin-Antikörper inkubiert. Die Platte wurde automatisch mit einem 4-fachen Objektiv mit Konfokalbildgebung auf einem CellInsight CX7 LZR HCS-Gerät abgebildet. Bei diesem Bild handelt es sich um eine maximale Intensitätsprojektion mehrerer Z-Schnitte. Der internalisierte mit pHrodo Red konjugierte Herceptin-Antikörper wird in den intrazellulären Vesikeln beobachtet. (E) Neurosphären wurden in Neurobasal Plus Medium mit Culture One Supplement von neuronalen Stammzellen (NSC) unterschieden. Lebende Neurosphären wurden dann mit Tubulin Tracker Deep Red 1 Stunde lang gefärbt. Die Platte wurde automatisch mit einem 4-fachen Objektiv mit Konfokalbildgebung auf einem CellInsight CX7 LZR HCS-Gerät abgebildet. Bei diesem Bild handelt es sich um eine maximale Intensitätsprojektion mehrerer Z-Schnitte. Tubulin Tracker Deep Red färbt die Neuriten in den Neurosphären, die von NSC unterschieden wurden. (F) HeLa-Zellen wurden mit einer Dichte von 5.000/Well auf einer U-Bodenplatte ausgestrichen und 24 Stunden lang in einem CO2-Inkubator inkubiert. Aktivierte T-Zellen wurden mit CellTracker Deep Red gekennzeichnet und jedem Well wurden etwa 5.000 Zellen hinzugefügt. Nach einer 2-stündigen Inkubation mit aktivierten T-Zellen wurden Sphäroide mit dem pHrodo Green AM Intracellular pH Indicator 30min lang gefärbt. Die Zellen wurden dann 3-mal mit PBS gewaschen und mit einem 4-fachen Objektiv mit Konfokalbildgebung auf einem CellInsight CX7 LZR HCS-Gerät abgebildet. Bei diesem Bild handelt es sich um eine maximale Intensitätsprojektion mehrerer Z-Schnitte. Intrazelluläre Verstärkung der Fluoreszenz von pHrodo Grün AM nach Zugabe von aktivierten T-Zellen.

Bildgebung und Analyse proliferierender Zellen in Sphäroiden

Analyse proliferierender Zellen in HeLa-Sphäroiden. Hela-Zellen wurden mit einer Dichte von 5.000/Well auf einer Nunclon Sphera U-Bodenplatte ausgestrichen und 24 Stunden lang in einem CO2-Inkubator inkubiert. Die Sphäroide wurden 24 Stunden lang mit 50 µM Hydroxyurea behandelt. Die Sphäroide wurden dann 30 min lang mit 10 µM 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin (EdU) gepulst. Die Sphäroide wurden dann mit PBS gewaschen und für proliferierende Zellen mit dem Click-iT EdU Alexa Fluor 488 HCS Assay gefärbt. Die Sphäroide wurden anschließend gewaschen und mit einem Ki67-Antikörper gefärbt, der mit Alexa Fluor 647 Farbstoff konjugiert wurde. Die Sphäroide wurden automatisch mit einem 10-fachen Objektiv mit Konfokalbildgebung auf einem CellInsight CX7 LZR HCS-Gerät abgebildet. Bei diesem Bild handelt es sich um eine maximale Intensitätsprojektion mehrerer Z-Schnitte. Die Sphäroide wurden als Objekt segmentiert, und EdU- und Ki67-positive Zellen wurden punktgenau innerhalb des Sphäroids quantifiziert. Sowohl EdU- als auch Ki67-positive Zellen wurden in Kontroll-Sphäroiden beobachtet. Bei mit Hydroxyharnstoff behandelten Sphäroiden verschwanden die aktiv proliferierenden S-Phasen-Zellen (EdU negativ) und es wurden nur Ki67-positive Zellen beobachtet.

Immunonkologische Anwendung: Bildgebung der T-Zellpenetration und Sphäroid-Tötung bei Lungenkrebs

T-Zellpenetration und Sphäroid-Tötung bei Lungenkrebs. Sphäroide wurden durch Aussäen von A549-Zellen mit Gibco Minimal Essential Medium (MEM) in Nunclon Sphera U-Bodenplatten und 2 Tage lange Kultivierung gebildet. T-Zellen, die mit Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28 aus humanen PBMCs isoliert wurden, wurden 72 Stunden lang aktiviert und mit dem CellTracker Deep Red Dye gekennzeichnet, bevor sie 4 Stunden lang zu Lungenkrebs-Sphäroiden hinzugefügt wurden. Die Zellen wurden mit CellEvent Caspase 3/7 Reagent markiert. Die T-Zellpenetration und Tumor-Zytotoxizität wurden mit der Lebendzell-Ganzsphäroid-Bildgebung auf der CellInsight CX7 LZR High-Content-Plattform bewertet. Aktivierte T-Zellen drangen in die Sphäroide (rot) ein und induzierten die Apoptose in den Zielzellen über die Sphäroiden, wie durch eine verstärkte Färbung mit CellEvent Caspase 3/7 Reagent (grün) zu sehen ist.