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获取高质量RNA的步骤

获取高质量RNA是进行很多分子实验(比如反转录定量PCR(RT-qPCR)、二代测序转录组分析、芯片分析、数字PCR、northern分析及cDNA文库构建等)的第一步,常常也是最重要的一步。为了获得最灵敏的生物学相关结果,在实际进行RNA纯化之前、之中及之后,会有很多重要的步骤。接下来的应用说明中讨论了样品收集、保存及RNA提取流程中的多个最佳实例,以最大化样品RNA的得率和质量。这些案例中的很多实验均使用了Ambion技术。

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优化RNA制备及分析

我们正在进行的对RNA制备及分析过程进行优化的研究已经发现了流程中的若干个关键点,其通常都可以进行提升,而且常常被忽视:

  • RNA提取前对样品的处理及操作
  • RNA制备的技术选择
  • 制备好的RNA样品的储存

大多数传统的RNA提取方法都是在RNA酶抑制剂(通常为强去污剂,如胍盐、十二烷基硫酸钠(SDS),或者是用于降低样品中RNA降解风险的苯基化合物等)存在的条件下进行的。然而,通常在RNA提取过程前后才是RNA完整性受损的风险最大的时候。

步骤 1: 样品收集及保护

根据您起始材料的不同,找到最适当的细胞或组织裂解方法是最大程度提高RNA制备产量和品质的关键。 根据您起始材料的不同,找到最适当的细胞或组织裂解方法是最大程度提高RNA产量和品质的关键。在RNA提取的样品破碎过程中,在细胞破碎的同时让细胞内含物与裂解液或变性剂充分接触是非常重要的。在以下这些情况下,这一点会比较麻烦:组织或细胞比较坚硬(例如骨骼,根等);样品中含有细胞壁或细胞小室(例如酵母、革兰氏阳性菌、孢子等);工作流程决定了收集样品后无法第一时间进行处理(例如,样品收集之后需要转运到其它地方进行样品处理);样品数量很多难以快速处理。解决上述问题的一个常用方法是用液氮或干冰冷冻组织/细胞。 通常对冷冻样品都要进行预处理以选择所需的重量或在用变性剂处理前先部分磨碎样品。虽然这种冷冻及预处理流程可以让研究人员更好地控制纯化条件,我们的经验以及客户的反馈证明这样操作非常复杂,需要花费很多时间,过程非常费力。

RNAlater试剂RNAlater-ICE样品保存 : RNA稳定溶液可以为研究人员提供更佳的灵活性及更长的保存时间,使得他们可以在组织收集后的数天、数周甚至数月后再进行RNA提取而不会影响RNA的完整性。解剖组织、体液或收集的细胞等样品可以简单地在室温下浸泡在RNAlater溶液中,冷冻的样品则可以浸泡在RNAlater-ICE 溶液中。这些溶液可以渗透进细胞中并且稳定RNA。样品可以在4°C条件下使用 RNAlater试剂,或在–20°C条件下使用RNAlater-ICE RNA稳定试剂来保存。此时可用湿冰来运输样品,如果只是过夜的话甚至可在室温下进行运输。图1显示了在4°C、室温甚至37°C条件下在 RNAlater 试剂 中保存的不同组织中提取得到的RNA的完整性情况。4°C条件下保存的样品可以提供完整的RNA,即使在保存一个月后依然完整。

图1. 从保存于RNAlater 试剂中的组织提取得到的RNA的质量。组织按照所标示的时间保存在RNALater试剂中,然后使用TRIzol试剂(Life Technologies)从组织中提取纯化得到RNA。对于每个样品,取等量的RNA使用Agilent 2100 Bioanalyzer™仪器进行了分析。上图显示了纯化的RNA用2100 Bioanalyzer分析得到的结果。下图则显示的是基于A260检测方法获得的产量信息。


使用 RNAlater 溶液进行组织保存可与大多数RNA提取流程相兼容。保存在RNAlater溶液中的组织可以被简单地取出并根据您选定的RNA提取流程在裂解缓冲液中使用Dounce homogenizer匀浆器、Polytron (Brinkmann)、珠子破碎或其他机械来进行匀浆。图2显示了使用不同方法从保存在RNAlater 溶液中的组织提取得到的RNA,并验证了RNA的质量、得率及RT-qPCR的信号检测等并未受到RNAlater溶液保存的影响,其中RT-qPCR使用了TaqMan Assay (Life Technologies)分析的方法。

 


图2. 保存在RNAlater试剂中的组织与不同RNA提取方法的兼容性。将新鲜解剖的小鼠整个肝脏和心脏分为几部分,然后立即处理一部分,其他则置入 RNAlater 溶液中并在4°C条件下保存三天,然后分别使用TRIzol试剂、PureLink试剂盒或MagMAX™-96总RNA提取试剂盒提取总RNA。相同量的RNA(X µg)通过Agilent 2100 Bioanalyzer™仪器进行了分析。上方panel显示了纯化样品在2100 Bioanalyzer™仪器中的印迹。下方panel则显示了基于A260测量得到的每组RNA样品的得率。

步骤 2: rna制备

目前有多种RNA制备技术可供使用,一般可归纳为四种通用技术:有机试剂萃取方法,离心柱法、磁珠法和直接裂解方法。虽然这几种方法都可以用于制备高质量RNA以用于多种分析技术,不过在选择合适的纯化方法时还是有几点需要注意。

样品是否特别难处理?

  • 含有大量核酸酶的组织或脂肪组织,以及含有大量抑制因子的样品可能会导致某些问题。

需要处理多少样品?

  • 大体积的样品要求试剂盒中的试剂可成比例放大。通常情况下,样品体积越大,则通量越小。

需要什么样的通量?

  • 某些处理方式非常适用于更高通量及自动化。

有机试剂萃取方法被认为是RNA制备中的金标准。在纯化过程中,样品在含有苯酚的溶液中进行了均质化然后离心。在离心过程中,样品会分为三层:下部的有机相,中层含有变性蛋白质及gDNA,而上层水相则含有RNA。然后将上层水相分离出来并通过乙醇沉淀及再溶解来获得RNA。

有机试剂萃取法的优势

  • 可以快速变性核酸酶并稳定RNA
  • 可调整的规模

有机试剂萃取法的缺点

  • 有机试剂氯化物的使用及产生的废弃物
  • 费力的手动处理流程
  • 难以自动化操作

基于滤膜的离心柱法使用了底部安置有膜(通常为玻璃纤维,硅衍生物或者离子交换膜)的离心柱。使用含RNase抑制剂(通常为胍盐)的缓冲液来裂解样品,然后利用离心力使裂解物通过膜来让核酸结合在膜上。随后使用清洗缓冲液来清洗膜然后丢弃缓冲液。接下来使用恰当的洗脱缓冲液通过离心的方式将样品洗脱下来并收集到管中。有些方法可以使用离心或者真空抽吸的方式来进行处理,后者需要使用特殊的收集系统。另外还有一些混合方法结合了有机试剂萃取的效率及离心柱法可以简单地完成样品收集、清洗、洗脱等步骤的优点。

离心柱法的优点

  • 方便,容易使用
  • 可进行单一样品和96孔板样品处理
  • 可以自动化操作
  • 可以制造多种规格的膜

离心柱法的缺点

  • 易被微粒物质阻塞
  • 大分子核酸如gDNA的残留
  • 制造规格决定了结合能力
  • 自动化处理时,需要复杂的真空抽提系统或离心系统

磁珠法所采用的小颗粒(0.5–1 µm)具有一个顺磁的核心,其外壳经过修饰可以和特定目标分子结合。磁珠在磁场中时会随着磁场而移动,但在移除磁场后几乎不保留磁力。这使得这些磁珠基于它们表面的修饰可以与感兴趣的分子相互作用,然后通过外源磁场快速地对它们进行收集,之后移除磁场并对磁珠进行重悬。对样品首先使用含RNase抑制剂的溶液进行裂解,然后与磁珠结合。再通过施加磁场将磁珠及其上结合的分子一起收集起来。通过数轮的释放、重悬于清洗溶液中,然后重新捕获的过程,最终将RNA释放到洗脱溶液中并移除磁珠。

磁珠介导纯化方法的优点

  • 没有滤膜堵塞的风险
  • 基于溶液的结合动力学可以增强目标捕获的效率
  • 磁性形式使得可以进行样品的快速收集/浓缩
  • 更易在仪器平台上处理
  • 可以自动化操作
  • 可用于表面修饰的化学基团丰富

磁珠法的缺点

  • 洗脱样品中可能残留磁珠颗粒
  • 磁珠在黏性溶液中移动缓慢
  • 手动操作时磁珠的捕获/释放操作很费力

直接裂解法进行样品制备(非纯化)时采用的裂解缓冲液,可以破碎样品,稳定核酸,同时与下游应用相兼容。通常,样品与裂解试剂混合在一起,在特定条件下孵育一段时间,然后直接用于下游分析。若有必要,可以对稳定后的裂解物进行纯化而得到样品。通过免去与固体表面的的结合及洗脱步骤,直接裂解法可以避免在其他纯化方法中可能会发生的偏差及对回收效率的影响。

直接裂解法的优点
非常快速简单

  • 最有可能准确反映样品中的RNA真实情况
  • 可以很好地应用于非常小量的样品
  • 可以进行简单的自动化操作
  • 可扩展性

直接裂解法的缺点

  • 不能用于传统的分析方法,例如通过分光光度法测定产量
  • 明显的稀释作用(对于浓缩样品更有效)
  • 为了取得最好的效果,往往需要根据下游应用进行优化。
  • 若没有正确处理裂解物则可能残留RNase活性

Ambion RNA提取试剂盒对于样品量、类型及处理形式非常灵活,包含了用于总RNA或poly(A) RNA提取的试剂盒。想要了解对于特定量的组织或细胞大约可以提取得到多少的总RNA或poly(A) RNA,请参考每个试剂盒提供的技术信息,或者联系Life Technologies的技术支持。

步骤 3: 提取的RNA的定量

RNA定量是大多数RNA分析方法之前的重要及必需步骤。这里我们讨论了三种常用定量RNA的定量方法及每种方法的优化技巧。

UV光谱分析

传统的评估RNA浓度及纯度的方法是UV光谱分析。对稀释的RNA样品测量其260及280 nm处的吸光值,根据Beer-Lambert法则(预测吸光度及浓度间的线性变化(图3)

 

 

图3.计算核酸UV吸光度的Beer-Lambert法则

在该公式中, A260读数为1.0相当于~40 µg/mL的单链RNA。而A260/A280比值则可以用来评估核酸纯度。A260/A280 比值在1.8-2.1之间时意味着高纯度的RNA。UV光谱分析是最常用的定量RNA的方法。该方法很容易实施,而大多数实验室中都有UV分光光度计。该方法具有一些缺点,不过通过以下技巧可以最小化这些缺点的影响:

  • 该方法无法分辨RNA和DNA,可以首先用无RNase的DNase来处理RNA样品以去除污染的DNA。
  • 其他污染物如残留蛋白质及苯酚等会影响到吸光度读数,所以在RNA纯化过程中要特别注意将它们去除。
  • 对样品的读取是在石英比色皿进行的。脏的比色皿和灰尘微粒会使320nm处的光发生散射,从而会影响到260 nm处的吸光值。由于蛋白质或核酸都不会吸收320nm的光,所以通过读取空比色皿(仅有稀释液)在320 nm处以及260 nm和280 nm的读数可以进行背景校正。
  • A260/A280比值同时依赖于pH值及离子强度。当pH升高时,A280读数会降低,而A260则不受影响。这会导致A260/A280比值的升高[1]。由于水通常都具有酸性pH值,它会降低A260/A280比值。我们推荐使用弱碱性pH的缓冲溶液,例如TE (pH 8.0)等,作为稀释液(及空白对照)来确保得到精确的可重复的读数。图4中显示了在不同pH值条件下A260/A280比值变化的示例。
  • 确保稀释后的RNA样品处于分光光度计的线性范围之内。通常吸光度读数应该在0.1到1.0范围内。溶液吸光度读数在该范围外时是无法进行准确测量的。通常来说浓度较低时发生的错误也更大。

图4. pH对A260/A280比值的影响


荧光染料


某些荧光染料,如 Quant-iT™ RiboGreen RNA试剂,在结合在核酸上时会表现出很明显的荧光增强。在标准荧光仪、荧光酶标仪或滤光荧光仪上使用RiboGreen试剂时可以对低至1 ng/mL的RNA进行检测和定量。为了正确地定量RNA,可以用已知浓度的样品在260 nm的吸光度来生成一条标准曲线,并将未知样品与标准曲线进行对比。当使用两个不同的染料浓度时RiboGreen试剂的线性定量范围可以跨越3个数量级(1 ng/mL 到 1 µg/mL)。更进一步地讲,Quant-iT™ RiboGreen RNA试剂分析方法不容易受到核酸制备过程中常见的非核酸污染物的影响,所以可以保持线性度。这种RNA定量方法可以用如下技巧来进行优化:

  • 除了RNA,Quant-iT™ RiboGreen RNA试剂还可以结合在DNA上并发出荧光。所以在定量之前可以先用RNase-free DNase来处理RNA样品以去除污染的DNA。
  • Quant-iT™ RiboGreen RNA试剂会吸附在管壁上。这可以通过使用无核酸酶的无粘附聚丙烯制品来制备溶液以最小化这种影响。
  • 注意保护RiboGreen RNA试剂防止发生光降解,可以通过用锡箔纸来包裹容器,并且在试剂制备好的数小时内使用。
  • 避免对RNA标准品进行反复冻融。这可能导致RNA链断裂,从而导致染料结合能力降低。另外,核酸在反复冻融过程中会吸附在管壁上。这种现象在较低浓度下更加明显。


Agilent 2100 Bioanalyzer™仪器

Agilent 2100 Bioanalyzer™仪器综合利用了微流体技术、毛细管电泳技术以及能与核酸结合的荧光染料,从而能对RNA的浓度及完整性进行评估检测。在将分离基质装填入Bioanalyzer™ Lab Chip后,可以将RNA ladder与样品分别加载到芯片上指定的孔道中。当RNA分子移动通过芯片通道时其荧光会给出分子大小和质量信息。仪器软件会自动地将未知RNA样品的峰值区域与6个Agilent RNA 6000 Ladder的RNA峰值的结合区域进行比较以确定未知样品的浓度。Agilent RNA 6000 Nano System具有宽广的动态范围,可以定量25–500 ng/µL的RNA,而Agilent RNA 6000 Pico Chip System则可以定量50–5,000 pg/µL范围的RNA。

Agilent 2100 Bioanalyzer™仪器最强力的特性可能是它可以提供有关RNA完整性的信息。当分析完每个RNA样品后,软件会同时生成类凝胶图和电泳图谱。在分析总RNA时,会使用一种分析算法来评估RNA样品的完整性(RNA完整性系数,即RIN),最大值为10。RIN的显著降低则表明了总RNA的降解。

步骤 4: 提取RNA的储存

每种RNA分离实验方案 (总RNA或mRNA制备) 的最后一步都是重悬纯化的RNA沉淀。在煞费苦心地制备了RNA样品之后,很重要的一点是保持RNA重悬并保存在安全的无RNase的环境中。我们推荐分装成单次用量并保存在–80°C条件下,以下是我们推荐的专为此目的设计的几种RNA保存液:

  • RNA储存液 (1 mM柠檬酸钠,pH 6.4 ± 0.2)
  • 0.1 mM EDTA(DEPC处理过的超纯水配制)
  • TE Buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.0)
  • RNAsecure™重悬溶液

TE和0.1 mM EDTA溶液常常被指定用于普通RNA提取和分析流程。对于那些已经在使用,但也更喜欢便捷性与安全性的研究人员而言,这些保存液是非常理想的。

我们还引入了THE RNA储存液,相比0.1 mM EDTA或TE溶液可以提供更佳的RNA稳定性。RNA储存液具有两项可以使RNA碱性水解作用最小化的特性:低pH值以及柠檬酸钠,柠檬酸钠可同时作为pH缓冲液和螯合剂发挥作用(二价阳离子可催化RNA碱性水解作用)。 RNA储存液适用于所有常用RNA应用领域,如逆转录、体外翻译、RNA分析和核酸酶保护分析。

RNAsecure™试剂是一种独特的非酶促试剂,可使酶促反应中的RNase发生不可逆的失活。它是以25X浓度来供应的,可加入到样品中使RNase失活。RNAsecure™重悬溶液包含有与RNAsecure™试剂相同的活性成分,不过是按工作浓度提供的,可以直接用于重悬RNA沉淀。为了使RNase失活,将RNA沉淀重悬于RNAsecure™重悬溶液中并在60°C下加热10分钟。RNAsecure™溶液的一个独特之处是在最初处理后通过重新加热可以再激活RNase破坏因子从而避免任何新的污染物的影响。

Life Technologies始终在致力于开发新的方法,使RNA分析变得更加简单。我们与我们的客户及合作伙伴紧密合作以提供独特的产品来帮助研究人员解决在处理RNA时常常遇到的问题。Ambion技术是RNAlater溶液、RNA提取试剂盒及RNA储存溶液的基础。Ambion RNA分析解决方案被设计用来协同工作以帮您完成从样品收集到RNA分析应用的一系列实验。若您觉得其他产品也有助于您的RNA研究,请联系我们。

参考文献

1. Wilfinger WW, Mackey K, and Chomczynski P (1997) Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques 22:474­481.

仅供研究使用。 不得用于人类或动物的治疗或诊断用途。