高效制备RNA是一种基础技术,需要一系列振奋人心、同时信息量丰富的分析技术,包括二代测序、反转录qPCR(RT-qPCR)、Northern印迹分析和cRNA制备。 转录组显示的保真性和回收RNA的质量与数量,会显著影响最终的分析。

样品采集、处理和储存过程中的各种因素,能对结果造成负面影响,应予以注意。 这些因素大致可以分为三类:

  • 处理前样品的稳定
  • 操作过程中的RNA回收
  • 将未受保护的样品暴露于RNases下

本文着重介绍了实验室制备RNA的最佳方案,并介绍了10项改善RNA纯化效果的方法。

  1. 立即灭活内源性的胞内RNA酶
  2. 使用适当的细胞或组织储存条件
  3. 彻底匀浆样品
  4. RNA分离前预处理匀浆
  5. 选择最好的RNA分离方法
  6. DNA酶处理
  7. 减少在环境RNA酶下的暴露几率
  8. 适当沉淀
  9. 重悬
  10. 储存
 

立即灭活内源性的胞内RNA酶

在收获组织和细胞死亡后,必须立即灭活内源性RNA酶,以避免RNA降解。

有3种有效方法能做到这一点:

  • 收获到离液序列高的细胞裂解溶液(如含胍)中后,立即匀浆样品。
  • 在液氮中瞬间冻结样品。 为了通过瞬间冷冻灭活RNA酶,务必要使组织块足够小,以达到在浸入液氮时能够几乎立即冻结。
  • 样品置于 RNAlater®组织收集液中: RNA稳定液,一种水溶性、无毒性的收集试剂,可以稳定并保护完整的、未冷冻组织和细胞样品中的细胞RNA(见下文#2) 最为关键的是,组织样品必须是薄片(0.5 cm)形式,以便于在RNA酶破坏RNA之前,RNAlater®能够迅速渗透到组织中。
 

采用适当的细胞或组织储存条件

当样品被瞬间冷冻后,必须储存于–80°C下,决不允许解冻。 即使是在胍裂解溶液中,匀浆前短暂解冻也可能会导致RNA的降解与损失。 瞬间冷冻组织应该在冻结状态下直接在离液序列高的裂解缓冲液中匀浆,或者在裂解溶液中匀浆之前,于低温下研磨或粉碎。

 

彻底匀浆样品

细胞或组织的彻底匀浆是RNA分离的一个重要步骤,同时可防止RNA的损失和降解。 匀浆方法应根据细胞或组织类型而定。 虽然多数培养细胞通过在细胞裂解缓冲液中简单的涡旋即可达到匀浆效果,但动物组织、植物组织、酵母和细菌常需要更严格的破碎方法。 例如,细菌细胞壁可能需要酶消化来实现彻底的细胞裂解和最大限度的RNA回收。

 

RNA分离前预处理匀浆

对于一些样品,在匀浆后和RNA分离前需要做额外的处理。 高脂肪含量的组织,如大脑和脂肪组织的裂解产物,应该用氯仿抽提,以去除脂类并提高RNA产量。 许多植物组织中的多酚和多糖含量很高,会降低RNA的质量和产量。 用植物RNA分离辅助试剂预处理这些裂解产物,可消除这些麻烦的化合物。

 

选择最好的RNA分离方法

有多种RNA分离方法可用,有时会很难决定要使用哪一种。 最简单,最安全的方法是用柱提的方法,如PureLink® RNA Mini试剂盒PureLink®Pro96试剂盒。这些步骤易于操作,是用来处理多个样品的理想选择。 MagMAX™-96总RNA分离试剂盒 MagMAX™-96微孔总RNA提取试剂盒采用顺磁性颗粒方法,易于实现自动化并避免部分组织可能发生的堵塞现象。 对于难处理的组织,例如核酸酶(胰腺)或脂肪(脑和脂肪组织)含量高的组织,建议采用更严格的 TRIzol®试剂,这是一种基于苯酚的RNA抽提方法。 如果追求制备分析用的组织培养细胞的最终性能和便利性,我们推荐Cells-to-CT™试剂盒系列。

 

DNA酶处理

产物RNA用于RT-PCR时,我们建议用DNA酶处理以去除残留的DNA污染。 从DNA含量高的组织如脾中分离RNA时,DNA酶处理也是不错的选择。 PureLink® DNA酶套装已优化可有效地在柱上去除RNA中的DNA,并提供处理样品所必须的试剂。 样品也可以用TURBO DNA-free™ DNA处理和去除试剂 扩增级DNA酶 I处理,以便于在用任何方法纯化前去除RNA中的DNA污染。 这两款产品都提供高品质的DNA酶 I和最佳的反应缓冲液,且提供了一种在处理后去除DNA酶快速简便方法,不需使用有机溶剂或冒险采用热处理方法。

 

减少在环境RNA酶下的暴露几率

要分离出完整、高品质的RNA,在制备RNA时,一旦RNA不再受强蛋白变性剂(如离液序列高的裂解溶液或苯酚衍生物)保护,隔离RNA酶是关键。 RNA酶几乎无处不在,因此确保任何与纯化RNA接触 的物品均不含RNA酶十分关键。 所有表面,包括移液器、台面、玻璃制品和凝胶设备,应当使用表面净化试剂如 RNaseZap®溶液 RNaseZap® Wipes进行净化处理。 应始终使用无RNA酶的吸头、试管和溶液,并经常更换手套。

 

适当沉淀

纯化的RNA可能需要沉淀浓缩,以用于下游应用。 用酒精(乙醇或异丙醇)沉淀RNA时,需要将一价阳离子(例如,0.2M的Na+、K+和0.5 M NH4+)的浓度控制到最低。 在对盐的浓度进行了调整后,通过添加2.5体积的乙醇或1体积的异丙醇并充分混合可将RNA沉淀,然后于–20°C下至少冷却15分钟。 冷却后,以12,000 x g转速将RNA旋转10分钟,并小心移去上清液。 虽然异丙醇沉淀RNA的效率稍差,但是在NH4+存在的情况下,它却能比乙醇溶液更好地使核苷酸游离于溶液中,使其与沉淀的RNA分开。 对于定量回收低浓度的RNA(纳克/毫升),应该使用惰性共沉淀(例如,糖原酵母RNA的线性丙烯酰胺)。 将RNA用于RT-qPCR时,应该选择线性丙烯酰胺和DNA酶处理的糖原来共沉淀,因为它们不含DNA污染。 酵母RNA和未处理的糖原会把核酸污染引入到样品中,可能使RT-qPCR的结果有偏差。 沉淀后移去上清液,避免RNA沉淀完全干燥,因为这会造成RNA难以重悬。

 

重悬

许多RNA分离步骤中的最后一步是重悬纯化的RNA沉淀。 重悬溶液的三个理想品质是:无RNA酶,微酸性pH值(pH值6 - 7),加入螯合剂以防止RNA被引入的RNA酶降解( RNA储存缓冲液全部满足这些标准)。 为了有助于溶解,RNA沉淀在重悬溶液中于65℃下孵育5分钟,并间歇性地温和涡旋。

 

储存

短期储存时,重悬的RNA应储存于–20°C下;长期储存时,应储存于–80°C下。 虽然重悬于水或缓冲液中的RNA可以在-80°C下储存,但-80℃下储存在NH4 OAc /乙醇沉淀混合物中的RNA是最稳定的。 我们推荐将RNA溶液分装到几个试管中。 这样做不仅能够预防反复冻融对RNA的损伤,也有助于防止意外的RNA酶污染。

仅供研究使用。 不得用于人类或动物的治疗或诊断用途。
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